Espaço para a discussão sobre a AHT (AUTO-HEMOTERAPIA) e envio de relatos sobre experiências dos usuários desta técnica terapêutica. A AUTO-HEMOTERAPIA é uma técnica simples, em que, mediante a retirada de uma pequena quantidade de sangue da veia e sua imediata aplicação no músculo, estimula um aumento dos macrófagos, que são as células sangüíneas que fazem a "limpeza" de tudo o que é prejudicial no organismo, eliminando bactérias, vírus, as células cancerosas, etc. Esse aumento da produção de macrófagos pela medula óssea (de 5% para 22%) se deve ao fato de que o sangue injetado no músculo funciona como um "corpo estranho" a ser rejeitado pelo Sistema Retículo Endotelial (SRE), o que faz com que o nível imunológico se eleve, permanecendo ativado durante 5 dias, após os quais o percentual de macrófagos vai decaindo até o sétimo dia, retornando aos 5%. Com isso, inúmeras doenças, inclusive as graves como as auto-imunes, regridem rapidamente, proporcionando o restabelecimento da saúde. A AHT, entretanto, não representa nenhum risco para o paciente e não produz efeitos colaterais. Este fórum se destina primordialmente àqueles que já utilizam a AHT e não possuem mais dúvidas sobre sua eficácia, mas também admite a discussão séria e responsável sobre o assunto, tendo em vista o envio de orientações sobre os detalhes da técnica, tanto para os que já a utilizam, como para os que desejam passar a utilizá-la e querem se informar melhor sobre a mesma.

Tags: tratamento medicina sangue enfermagem autohemoterapia anvisa crm auto-hemoterapia coren cfm sus
03/06/2014 03:49
De: Fetha
IP: 191.229.129.93

Auto-hemoterapia curando gangrena na perna (01:39)

Auto-hemoterapia curando gangrena na perna (01:39)
https://www.youtube.com/watch?v=_cx_WtxU6NY
duração do vídeo: 1 minuto e 39 segundos
A foto mostrada neste vídeo foi postada por AutoHemoterapia Saúde no Facebook.
Brevemente colocarei mais fotos, cada vez mais o dono dessa perna está sendo curado com Autohemoterapia e cloreto de magnésio!
-
A melhora do quadro é impressionante!
-
* PARA AJUDAR NA DIVULGAÇÃO DA AUTO-HEMOTERAPIA:
Lembre-se que contra fatos e fotos não há argumentos!
*** ENTÃO SUA AJUDA É MUITO IMPORTANTE. ***
Faça sua parte, divulgando seu testemunho. Muitas pessoas já fizeram. Divulgue seus laudos, fotos, exames e outros documentos, mostrando de maneira clara, que a auto-hemoterapia é eficaz e muito benéfica.
-
* AUTO-HEMOTERAPIA. MEU SANGUE ME CURA!
http://www.youtube.com/worldautohemotherapy
http://pdfcast.org/profile/marcelo%20fetha
http://www.hemoterapia.org/
http://amigosdacura.ning.com/
http://www.rnsites.com.br/auto-hemoterapia.htm
http://hssuffer.wordpress.com/auto-hemoterapia-sangue-que-cura http://inforum.insite.com.br/66763/
-
* Grupos AHT no Facebook:
AMIGOS DA CURA:
https://www.facebook.com/groups/422963371070990/
AUTOHEMOTERAPIA DO MUNDO LUSOFONO PARA O PLANETA:
https://www.facebook.com/groups/lusofons/
Auto-Hemoterapia-Adeptos e Usuários:
https://www.facebook.com/groups/sanguecura/
Hémoterapia, O Sangue que Cura Eu faço:
https://www.facebook.com/groups/sanguequecura/
Pesquisando a Auto-hemoterapia:
https://www.facebook.com/groups/tudosobreautohemoterapia/
Auto-hemoterapia (CURA)
https://www.facebook.com/groups/595618827135683/
AUTO HEMOTERAPIA:
https://www.facebook.com/groups/Auto.Hemoterapia/
AUTO-HEMOTERAPIA NOSSO SANGUE NOS CURA E OS ANJOS TB!!:
https://www.facebook.com/groups/autohemoterapianossosanguenoscuradetd/
01/04/2008 10:45
De: Robert N. Johansson (robert.norman@itelefonica.com.br)
IP: 201.43.77.178

Re: Aplicação AHT

LUIS: dificilmente alguem irá se expor publicamente oferecendo serviço de AHT aqui no fórum pois há uma "caça às bruxas" em andamento, à partir do comunicado da ANVISA e do parecer do CRM.
A maneira de obter o serviço tem que ser outra. Procure conhecer pessoas que já estão fazendo e obtendo resultados. Troque e-mail com elas. Assim chegarão as informações necessárias para vc decidir se vai ou não tentar a Auto-hemoterapia.
Um abraço,
26/10/2011 00:57
De: M.Fetha
IP: 189.63.218.113

Comentario em video no youtube, confirma curas e melhora em caso de ulcera varicosa com a auto-hemoterapia

Comentário postado no vídeo: Fraude forjada - Auto-hemoterapia no Fantástico http://www.youtube.com/watch?v=nVgGLi6arfk
Se dizem ser FRAUDE continuem dizendo.
O problema é que o assunto atinge a Industria Farmaceutica e a toda chamada classe Médica.
Não conhecia o assunto, mas conheço duas pessoas que atingiram a cura.
Um com problema de Renite e o outro com problemas de inchaço nas pernas, este último tinha dias que não podia andar.
Após várias aplicações sumiram os seus problemas.
Tenho 49 anos e estava com um problema sério de Úlcera Varicosa na perna esquerda.
-
CONTINUAÇÃO.
Hoje faço o tratamento.
Já fiz 16 aplicações de 5 e 10 ml, estou sentindo resultados.
Pois, toda semana tiro fotos e as comparo.
Se realmente eu conseguir a cura desejada irei postar no Youtube, concerteza.
Se não também erei postar dando o meu depoimento.
Um certo Doutor aqui em Natal RN, me receitou uma determinda pomada que usei durante 2 anos e não vi resultados, de regressão do ferimento, apenas ficou estagnado.
Com respeito aos Médicos, pois, tenho uma irmã médica.
ivobass01:
http://www.youtube.com/user/ivobass01
-
@ivobass01 - Obrigado pelo comentário. Estou torcendo pela sua cura!
Se você ainda não viu, veja na minha página o? vídeo: Auto-hemoterapia curas úlcera na perna e registro fotográfico de tratamento em canino e o vídeo da Reunião de avaliação da UNIPAC sobre a Autohemoterapia (tem a foto do pai da depoente. Ela conta que a ferida do pai fechou).
E veja nos meus favoritos, procure pelo video: AUTOHEMOTERAPIA SI CURA
de luarzerimar1 (também se curou de úlcera na perna).
Abraço,
M. Fetha
worldautohemotherapy há 1 segundo
26/11/2012 19:55
De: Fetha
IP: 186.254.197.185

Links para os artigos do Dr. Jorge Martins Cardoso (Médico) - CRM 573

Textos do Dr. Jorge Martins Cardoso (Médico) - CRM 573
Índice dos artigos
Médico: alegrias e tristezas...
http://www.geocities.ws/autohemoterapiabr/medico_alegrias_tristezas.html http://autohemoterapia.orgfree.com/medico_alegrias_tristezas.html http://www.geocities.ws/autohemoterapiabr/medico_alegrias_tristezas.pdf http://autohemoterapia.orgfree.com/medico_alegrias_tristezas.pdf O (s) conselho (s), o médium, a auto-hemoterapia e...
http://www.geocities.ws/autohemoterapiabr/conselhos_medium_autohemoterapia.html http://autohemoterapia.orgfree.com/conselhos_medium_autohemoterapia.html http://www.geocities.ws/autohemoterapiabr/conselhos_medium_autohemoterapia.pdf http://autohemoterapia.orgfree.com/conselhos_medium_autohemoterapia.pdf Auto-Hemoterapia: ciência ou religião? (I a IV)
http://www.geocities.ws/autohemoterapiabr/autohemoterapia_ciencia_religiao_1_a_4.html http://autohemoterapia.orgfree.com/autohemoterapia_ciencia_religiao_1_a_4.html http://www.geocities.ws/autohemoterapiabr/autohemoterapia_ciencia_religiao_1_a_4.pdf http://autohemoterapia.orgfree.com/autohemoterapia_ciencia_religiao_1_a_4.pdf Auto-Hemoterapia, Dr. Fleming e os antibióticos...(I a 50)
http://www.geocities.ws/autohemoterapiabr/autohemoterapia_dr_fleming_1_a_50.html http://autohemoterapia.orgfree.com/autohemoterapia_dr_fleming_1_a_50.html http://www.geocities.ws/autohemoterapiabr/autohemoterapia_dr_fleming_1_a_50.pdf http://autohemoterapia.orgfree.com/autohemoterapia_dr_fleming_1_a_50.pdf Auto-Hemoterapia, Dr. Fleming e os antibióticos...(51 a 100)
http://www.geocities.ws/autohemoterapiabr/autohemoterapia_dr_fleming_51_a_100.html http://autohemoterapia.orgfree.com/autohemoterapia_dr_fleming_51_a_100.html http://www.geocities.ws/autohemoterapiabr/autohemoterapia_dr_fleming_51_a_100.pdf http://autohemoterapia.orgfree.com/autohemoterapia_dr_fleming_51_a_100.pdf Auto-Hemoterapia, Dr. Fleming e os antibióticos...(101 a 150)
http://www.geocities.ws/autohemoterapiabr/autohemoterapia_dr_fleming_101_a_150.html http://autohemoterapia.orgfree.com/autohemoterapia_dr_fleming_101_a_150.html http://www.geocities.ws/autohemoterapiabr/autohemoterapia_dr_fleming_101_a_150.pdf http://autohemoterapia.orgfree.com/autohemoterapia_dr_fleming_101_a_150.pdf Obs: próximo arquivo:
autohemoterapia_dr_fleming_151_a_200.html
Os LINKs para novos PDFs e HTMLs atualizados poderão ser encontrados nos sites:
AHT HEMOTERAPIA, na seção Publicações:
http://www.hemoterapia.org/aht_hemoterapia_publicacoes.asp
AUTO-HEMOTERAPIA. MEU SANGUE ME CURA:
http://www.rnsites.com.br/auto-hemoterapia.htm
AMIGOS DA CURA:
http://amigosdacura.ning.com/
-
TODOS os Artigos do Dr. Jorge Martins Cardoso (Médico) - CRM 573
arquivos PDFs no SITE AMIGOS DA CURA:
http://amigosdacura.ning.com/profiles/blogs/textos-do-dr-jorge-martins-cardoso-m-dico-crm-573
09/05/2011 00:36
De: MFetha
IP: 189.123.81.154

Sucesso da auto-hemoterapia em Portugal

Domingo, 8 de maio de 2011 - 12:00:04 201.51.224.218

Umn pouco da AH em Portugal:
guidamassano
Re: Auto-Hemoterapia
« Responder #7 em: Abril 25, 2011, 18:56:38 »
________________________________________
Boa tarde
Sou enfermeira portuguesa, eu própria sou usuária desta terapia e aplico a quem me pedir.
Neste momento aplico a auto-hemoterapia em cerca de 20 pessoas sem contar com todos os meus familiares que me estão próximos geograficamente.
Numa outra postagem minha, relatei que tive conhecimento da técnica, pela boca de um colega largamente experiente, em 1976.
Posso garantir que resulta espantosamente, e não vamos falar do efeito placebo, porque como certamente já puderam ler usa-se a auto-hemoterapia em veterinária, logo efeito placebo? Alguns dos doentes que sigo só posso fazer registo dos seus relatos verbais de melhoria ou cura, mas outros tem provas analíticas espantosas. Ecografias de quistos que desapareceram, registos fotográficos da evolução espantosa da psoriase, analises de portadores de HIV com subida das defesas espantosas, alergias que deixaram de existir,etc.
Compreendo quem esteja um pouco séptico, mas não há como negar as evidências.
O procedimento é simples para qualquer enfermeiro: 1 colheita de sangue e 1 aplicação imediata IM profunda, doente não refere dor ao injectar. Não há aparecimento de hematoma no local da aplicação, alguns doentes, mais magros referem ligeiro desconforto ao toque, na zona da aplicação e normalmente só no 1º dia.
Perguntam muitas vezes os colegas se têm de heparinizar a seringa. Não, nada deve ser acrescentado ao sangue, aplicação deve ser imediata IM, só decorre o tempo de mudar a agulha de colheita, para uma mais longa.
Se algum colega tiver mais dúvidas que queira esclarecer, estou à disposição.
Em http://www.forumenfermagem.org/forum/index.php?topic=6436.0
Olivares Rocha
46 anos
http://www.hemoterapia.org/informacoes_e_debate/ver_opiniao/umn-pouco-da-ah-em-portugal-guidamassano-re-auto.asp
23/06/2008 12:05
De: OLIVARES
IP: 200.20.24.250

REPORTAGEM SOBRE A AUTO-HEMOTERAPIA OU SOBRE O TRATAMENTO DO CÃNCER COM CÉLULAS DO SANGUE NA RÁDIO MANCHETE - RJ

Bom dia. Soube que hoje pela manhã houve um debate sobre a Ah ou sobre o tratamento polêmico que usa sangue e que curou um doente de câncer, na rádio Manchete, do RJ 760 MHz, no programa do radialista Mário Belizário. Gostaria que ouviu a reportagem fornecesse maiores detalhes, para melhores esclarecimentos...
25/02/2010 11:00
De: Renata do Nascimento Pinto (renatasenadorpompeu@yahoo.com.br)
IP: 200.141.192.102

Dúvidas sobre a auto-hemoterapia

Gostaria de saber do Dr. Luis Moura se há riscos da utilização da técnica em casos de pacientes que tomam medicamentos químicos. Os seus compostos se mantêm no sangue, e estes poderão causar alguma reação ou efeito colateral ao organismo com a prática da auto-hemoterapia?
Gostaria também de saber do Dr. Luis Mouse se a aplicação pode ser feita por auxiliares e/ou técnicos em enfermagem, que não tenham tido treinamento específico para a realização da prática?
Aguardo ansiosa pelos esclarecimentos, pois sou grande admiradora das prática naturais em saúde, inclusive trabalho com atendimento em auriculoterapia por acupuntura.
Grata!
Renata do Nascimento Pinto
29/08/2012 21:01
De: Fetha
IP: 177.82.93.8

Egipicio posta comentario no video em o professor Waldo Vieira critica a auto-hemoterapia

Egipicio posta comentario no video de Waldo Vieira
Tradução via Google
Eu sou egípcio e eu vivo no Egito têm perda de cabelo de todo o meu corpo há 10 anos uma doença chamada Vixen tentou todos os medicamentos não veio comigo a qualquer resultado, quando ouvi sobre auto sangue tratamento espantado e disse: É este razoável e quando eu vi o vídeo para este processo eu tenho a coragem ea injeção já implementada há duas semanas e surpresa, eu vi mostra cabelos descoloridos pequenos na minha cabeça e no meu queixo e esta segunda injeção tomada a cada 7 dias que eu li e ouvi e, sinceramente, eu não esperava esse resultado rápido obrigado obrigado obrigado koko5000able 39 Minutos Atrás
Mensagem Original abaixo:
انا مصرى واعيش فى مصر وقد تساقط الشعر من كل جسمى منذ 10 سنوات مرض يسمى
الثعلبة وقد وجربت جميع الادوية ولم تأتى معى بأى نتيجة وعندما سمعت عن العلاج بالدم الذاتى استغربت وقلت هل هذا معقول وعندما شاهدت الفيديو الخاص بهذه العملية جائتنى الشجاعة وبالفعل نفذت الحقن منذ اسبوعين والمفاجاة فقد رأيت شعر ابيض صغير يظهر فى رأسى وفى ذقنى وهذه ثانى حقنة اخذها كل 7 يوم كما قرأت وسمعت وبصراحة لم اتوقع هذه النتيجة السريعة شكرا لكم شكرا لكم شكرا لكم
koko5000able 39 minutos atrás
07/12/2012 15:15
De: Fetha
IP: 177.167.32.83
22/03/2014 00:36
De: Fetha
IP: 191.225.160.89

Re: Três casos de pápulas urticariformes pruriginosas e placas de gravidez (PUPPP) tratados com injeção intramuscular de sangue autólogo

Email do Dr Shakman
Fazia tempo que eu não trocava emails com ele, mas alguém repassou um email meu a ele, e ele me escreveu e eu respondi.
O Dr Shakman é sem dúvida um dos maiores pesquisadores da AHT e o seu manual é de suma importancia, embora ele tb saiba e concorde que a AHT, provavelmente decole, quando já não mais estivermos por aqui ... neste planeta atrasado!
De qualquer forma é bom saber que ao que parece ele continuará a luta nos USA.
Re(2): Fwd: AUTO-HEMOTERAPIA: Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology: 2014
Prezado Dr Shakman
Muito obrigado pelo seu email e por suas palavras.
Sem dúvida, o senhor é um dos pioneiros em pesquisas e divulgação da auto-hemoterapia.
Aprendi a lição de seu último email, onde me ensinou que nós não vamos mudar o mundo, mas de alguma forma construimos um banco de dados que possa ajudar aos que necessitarem de informações verdadeiras da AHT.
Eu vi seu video do Youtube, mas ainda não mudei minhas contas para Google+, e quando eu o fizer, eu vou positivar os seus videos.
Parabens pelo seu video e pelo seu brilhante trabalho.
Um forte abraço do amigo,
M.Fetha
Dear Dr Shakman
Thank you for your email and for your kind words.
Without doubt, you are one of the pioneers in research and dissemination of auto-hemotherapy.
I learned the lesson of your latest email, which taught me that we will not change the world, but somehow we build a database that can help those who need real  information about AHT.
I saw your video on YouTube, but I not yet moved my accounts to Google+, and when I do, I'll positivate your videos.
Congratulations for your video and your brilliant work.
Sincerely friend
M.Fetha
Tradução via Google
Re: Fwd: AUTO-HEMOTERAPIA: Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology: 2014
Caro Sr. Fetha, et al.
Obrigado por suas contínuas boas obras e encaminhamento de informações sobre o tema da auto-hemoterapia. Embora a realidade da auto-hemoterapia persiste não apenas no nome, mas também dentro de inúmeras práticas claramente associados, por exemplo, incluindo os modernos conceitos de "sangue-spinning" e terapia com células-tronco autologoous usando células estaminais do sangue, etc, o método histórico e comprovado tradicional após Ravaut 1913 tende a não chamar a atenção e crédito merecido. Seus lembretes contínuos são de valor inestimável e muito apreciado.
Obrigado também para os vídeos enviados no passado. Lamento que eu não tenha aproveitado no passado, mas mantê-las como eu estou aberto a locais potenciais para a apresentação. Claro que a disponibilidade geral de vídeos no youtube.com torna a tarefa um pouco mais fácil, mas há situações em que este não está disponível, caso em que seus vídeos são uma alternativa pronta.
Atenciosamente,
SHAK
InstituteOfScience.com
-
Dear Mr. Fetha, et al.
Thank you for your continued good works and referral of information on the subject of autohemotherapy.  Although the reality of autohemotherapy persists not only in name but also within numerous clearly associated practices, e.g., including the modern concepts of "blood-spinning" and autologoous stem cell therapy using blood stem cells, etc., the traditional historic and proven method after Ravaut 1913 tends to not get the attention and credit deserved.  Your continued reminders are invaluable and much appreciated.
Thank you also for the videos sent in the past.  I regret that I have not taken full advantage of them in the past, but retain them as I am open to prospective venues for presentation.  Of course the general availability of videos on youtube.com makes the task somewhat easier, but there are situations wherein this is not available, in which case your videos are a ready alternative.
Sincerely,
SHAK
InstituteOfScience.com
-
18/10/2011 14:41
De: M.Fetha
IP: 189.63.210.237

18/10/2011 - 10:00 Auto-hemoterapia, Dr. Fleming e os antibióticos... (72)

Auto-hemoterapia, Dr. Fleming e os antibióticos... (72)
JornaldaCidade.Net
Jorge Martins Cardoso - Médico – CRM 573
Bem leitores da rede AHT. Bem leitoras da rede Record. Tudo legal? Hoje daremos continuidade à história "trepidante" do Sr. Virchow, aquele sujeito. Antes, o nosso principal intervalo.
Intervalo musical - A luta contra a debilitante paralisia infantil (poliomielite) continua, e a luta a favor da saúde, a favor da inofensiva AHT (auto-hemoterapia), também continua.
LEIA NA INTEGRA: http://www2.jornaldacidade.net/artigos_ver.php?id=16323
09/11/2015 14:34
De: Olivares rocha
IP: 189.126.205.12

Estudos sobre a Ah há. O que não há é interesse mercadológico. Somada à fosfoamina seria a cura

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
Joyce Nunes Vieira
ESTUDO DA HEMOTERAPIA NO MODELO DE ASMA
ALÉRGICA INDUZIDA POR OVALBUMINA (OVA) EM
CAMUNDONGOS
RIO DE JANEIRO
2015
Joyce Nunes Vieira
ESTUDO DA HEMOTERAPIA NO MODELO DE ASMA
ALÉRGICA INDUZIDA POR OVALBUMINA (OVA) EM
CAMUNDONGOS
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós Graduação em Ciências
(Microbiologia) no Instituto de Microbiologia
Paulo Goés na Universidade Federal do Rio
de Janeiro, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Mestre em
Ciências (Microbiologia).
Orientador: Marcelo T. Bozza
RIO DE JANEIRO
2015
I
S000 Vieira, Joyce Nunes
ESTUDO DA HEMOTERAPIA NO MODELO DE ASMA ALÉRGICA
INDUZIDA POR OVA
(OVA) EM CAMUNDONGOS/ Joyce Nunes Vieira. Setembro/2015.
64p. f.: il.
Dissertação (Mestrado em Microbiologia) –
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto
de Microbiologia Paulo de Góes IMPG, Rio de Janeiro, 2015.
Orientador: Marcelo Torres Bozza
1. Imunidade e Inflamação. 2. Asma 3. OVA e Hemoterapia. 4.
Dissertação Microbiologia
– Teses
I. Bozza, Marcelo Torres (Orient.).II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas – Microbiologia. Instituto de Microbiologia Paulo de Góes –
IMPG. III. ESTUDO DA HEMOTERAPIA NO MODELO DE ASMA
ALÉRGICA INDUZIDA
POR OVA (OVA) EM CAMUNDONGOS
CDD:
II
Joyce Nunes Vieira
Estudo da hemoterapia no modelo de asma
alérgica induzida por ovalbumina (OVA) em
camundongos
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas (Microbiologia), Universidade Federal
do Rio de Janeiro, como requisitos parcial à
obtenção do título de Mestre em Ciências
Biológicas (Microbiologia).
Aprovada em / /
_____________________________________________________
_____
(Marcelo Torres Bozza, Professor do Departamento de Imunologia
– IMPG/UFRJ)
_____________________________________________________
_______
(Alberto Félix da Nóbrega – Professor do Departamento de
Imunologia – IMPG/UFRJ)
_____________________________________________________
_______
(Flavio Alves Lara – Pesquisador do Instituto Oswaldo Cruz -
FIOCRUZ)
_____________________________________________________
_______
(Priscilla Christina Olsen, Professora da Faculdade de Farmácia –
UFRJ)
_____________________________________________________
__________
(Leonardo Nimrichter, Professor do Departamento de Imunologia –
IMPG/UFRJ)
_____________________________________________________
__________
(Juliana Echevarria Lima, Professora do Departamento de
Imunologia – IMPG/UFRJ)
Joyce Nunes Vieira
III
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus primeiramente. Agradeço aos meus pais Sara e Neivaldo por me ensinarem
tudo, a ter foco, dedicação e paixão, por me ensinarem o valor do estudo, e por me lembrarem
sempre que o mundo pode me tirar tudo, menos o conhecimento.
Agradeço ao meu noivo Aloisio, pela sua paciência e atenção.
Obrigada por perder seu tempo
lendo e debatendo comigo sobre meus trabalhos, e por me
incentivar sempre a ser melhor, não só
na vida profissional, mas também pessoal.
Obrigada ao meu orientador Marcelo Bozza por ter aceitado uma aluna de mestrado vinda lá de
longe, sem muita bagagem ou referências. Muito obrigada sempre por acreditar em mim. Obrigada
Heitor De Paula, o melhor co-orientador que eu poderia ter!
Obrigada pelas suas idéias,
ensinamentos, e por acreditar em mim mais do que eu mesma
muitas vezes.
A todos do laboratório de Inflamação e Imunidade, Andreza,
Caroline, Daniel, Danielle, Elisa,
Ellen, Fabianno, Fabrício, Hilton, Isabelle, Jennifer, Lara, Letícia Alves, Letícia Lintomen,
Luciana, Luiz, Marianna, Rafael, Sheila e Thamara. Agradeço a vocês por me ensinarem
tanto, por fazerem meus dias mais alegres, por se tornarem mais que colegas de trabalho, por
serem meus amigos. Já estou repleta de saudades e saibam que estarei com todos sempre no
coração e nas memórias hilárias.
As professoras Priscilla Olsen e Juliana Eshevarria pelos
conselhos, dicas e ajuda com toda a
boa vontade em todas as vezes que precisei.
Agradeço também aos técnicos Allyson e Nazioberto do Hospital Universitário pela ajuda e
ensinamento nas colorações e a técnica Daiana da FIOCRUZ por realizar os testes de hiperreatividade,
e ao Jamil pela ajuda nas quantificações de muco e colágeno.
E agradeço a banca, os professores Flávio Lara, Priscilla Olsen, Alberto Nóbrega, Leonardo
Nimrichter e Juliana Eshevarria, e a minha revisora Luciana Arruda.
IV
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Esquema mostrando o procedimento da
hemoterapia................................................13
Figura 2. Mapa epidemiológico da distribuição dos indivíduos asmáticos....................................16
Figura 3. Esquema modificado da resposta imune inata na asma alérgica ....................................19
Figura 4. Esquema modificado da resposta Th2 na asma
alérgica..................................................21
Figura 5. Desenho experimental do
tratamento..............................................................................24
Figura 6. Contagens total e diferencial de células no
BAL............................................................32
Figura 7. Contagens total e diferencial de células no
sangue.........................................................34
Figura 8. Contagens total e diferencial de células no
BAL............................................................37
Figura 9. Contagens total e diferencial de células no
sangue.........................................................39
Figura 10. Contagens total e diferencial de células na medula óssea.............................................41
Figura 11. Quantificação de IL-4 no BAL e homogenato
pulmonar..............................................44
Figura 12. Quantificação de IL-5 no BAL e homogenato
pulmonar.............................................46
Figura 13. Quantificação de IL-13 no BAL e homogenato
pulmonar...........................................48
Figura 14. Quantificação de
colágeno............................................................................................
.50
Figura 15. Quantificação de
muco..................................................................................................
52
V
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Concentrações de anticorpos dos kits de ELISA
Peprotech............................................28
Tabela 2. Dados representados em Média±Erro padrão da média
(SEM) do número de leucócitos
no BAL
...........................................................................................................
.................................31
Tabela 3. Dados representados em Média±Erro padrão da média
(SEM) do número de leucócitos
no
sangue...............................................................................................
..........................................33
Tabela 4. Dados representados em Média±Erro padrão da média
(SEM) do número de leucócitos
no BAL
...........................................................................................................
................................36
Tabela 5. Dados representados em Média±Erro padrão da média
(SEM) do número de leucócitos
no
sangue...............................................................................................
...........................................38
Tabela 6. Dados representados em Média±Erro padrão da média
(SEM) do número de leucócitos
na medula
óssea.................................................................................................
...............................42
Tabela 7. Dados representados em Média±Erro padrão da média
(SEM) da quantificação de IL-4
por
ELISA.................................................................................................
...................................43
Tabela 8. Dados representados em Média±Erro padrão da média
(SEM) da quantificação de IL-5
por
ELISA.................................................................................................
.....................................45
Tabela 9. Dados representados em Média±Erro padrão da média
(SEM) da quantificação de IL-13
por
ELISA.................................................................................................
....................................47
Tabela 10. Dados representados em Média±Erro padrão da média (SEM) da quantificação
colágeno............................................................................................
..............................................49
Tabela 11. Dados representados em Média±Erro padrão da média (SEM) da quantificação
muco..................................................................................................
..........................................51
VI
LISTA DE ABREVIATURAS
Α Alfa
Β Beta
Γ Gama
μ Micro
AHR Airway hiperresponsiveness / Hiperreatividade
brônquica
AHT Auto-hemoterapia
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
APC Antigen presentin cells / Células apresentadoras de
antígenos /
BAL Bronchoalveolar lavage / Lavado broncoalveolar
BR Bilirrubina
BV Biliverdina
BUXCO Pletismografia de corpo inteiro
CCL Chemokine (c-c motif) ligand / Ligante de
quimiocina
CCR c-c chemokine receptor / Receptor da quimiocina 3
/
CD4 Cluster of differentation / Grupamento de
diferenciação 4
CO Monóxido de carbono
DC Dendritic cells / Células dendríticas
DMSO Dimetilsufóxido ou sufóxido de dimetilo
ELISA Ensaio imunoenzimático
Fe Ferro
FcδR Receptor Fc delta
GM-CSF Granulocyte macrophage colony-stimulating
factor / Fator estimulador de colônia de
granulocito e macrófago
H2O2 Peróxido de Hidrogênio
HDM House dust mite / Ácaro da poeira doméstica
HE Hematoxilia-Eosina
HLA-DR Human leukocyte antigen / Receptor de antigeno
leucocitário humano
HO Heme-oxigenase
IFN Interferon
IgE Imunoglobulina E
IL-4, IL-5, IL-13, IL-25, IL-33… Interleucinas
i.m Intramuscular
i.n Intranasal
i.p Intraperitoneal
LTB4 Leucotrieno B4
MBP Major basic protein / Proteína básica maior
Mg Miligrama
VII
mL Mililitro
MHC Major Histocompatibiliti complex / Complexo de
histocompatibilidade
N Número
NADPH Dicotinamide adenine dinucleotide phosphate
NEA Asma não-eosinofílica
NFĸB Nuclear factor kappa B / Fator nuclear kappa B
Ng Nanograma
NKT Natural killer T
Nrf2 Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2
O3 Ozônio
OVA Ovalbumina
PAS Periodic Acid Shiff / Ácido periódico de Schiff
PBS Phosphate buffer saline / Tampão fosfato salino
PCB Proteína catiônica básica
PCR Reação em cadeia da polimerase
PE Peroxidase eosinofílica
Penh Enhanced pause / Pausa aumentada
Pg Picograma
PRR Pattern recognition receptor / Receptor de
reconhecimento padrão
PGE2 Prostaglandina E2
RANTES Regulated on activation, normal T cell expressed
and secreted
RNS Reactive nitrogen species / Espécies reativas de
Nitrogênio
ROS Reactive oxygen species / Espécies reativas de
oxigênio
Rpm Rotações por minute
SEM Média±erro padrão da média
SnPP Estanho protoporfirina
Th T helper
TGF Transforming growth fator
TMB 3,3´5,5´tetrametilbenzidina
TNF Tumoral necrose fator / Fator de necrose tumoral
TSLP Thymic stromal lymphopoietin / Linfopoietina
estromal tímica
UV Ultra-violeta
WHO World Health Organization / Organização Mundial
de Saúde
VIII
RESUMO
VIEIRA, Joyce Nunes. O ESTUDO DA HEMOTERAPIA NO
MODELO DE ASMA ALÉRGICA
INDUZIDA POR OVALBUMINA (OVA) EM CAMUNDONGOS.
Dissertação (Mestrado em
Ciências Biológicas - Microbiologia) Instituto de Microbiologia Paulo de Góes - IMPG, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2015.
A hemoterapia é um tratamento terapêutico antigo, de baixo custo e que consiste na retirada de
sangue do paciente e a reaplicação intramuscular. Esse tratamento já foi utilizado em uma grande
variedade de doenças e condições com diversos relatos positivos, no entanto, estudos de eficácia
terapêutica ainda não foram realizados. Escolhemos para o estudo da hemoterapia e seus efeitos o
modelo da asma alérgica induzida por ovalbumina (OVA) em
camundongos. A asma é uma doença
respiratória que afeta cerca de 300 milhões de pessoas em todo o mundo, e seus principais sintomas
são tosse, sibilos e falta de ar. É uma doença caracterizada por obstrução e inflamação das vias aéreas,
e hiper-reatividade brônquica a vários estímulos. De cunho
inflamatório, é dirigida por uma resposta
Th2 com a atuação de diversos tipos celulares da imunidade inata e adaptativa, sendo os eosinófilos as
células mais importantes na patogênese da asma. O objetivo desse projeto é, portanto, analisar o efeito
terapêutico do uso do sangue no modelo de asma induzida por
OVA em camundongos. Camundongos
Balb/C foram sensibilizados duas vezes com injeções
intraperitoneais (i.p) de OVA com Hidróxio de
alumínio (Al(OH)3) ou salina, e depois desafiados por 6 vezes com OVA intranasal (i.n), entre os
desafios injetamos por 4 vezes pela via intramuscular (i.m) salina, sangue ou suas frações (plasma e
hemácias). Após o tratamento avaliamos diversos parâmetros
inflamatórios da asma incluindo o
recrutamento leucocitário para os pulmões, o número de leucócitos no sangue e na medula, a
concentração de citocinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) nos extratos pulmonares, a hiper-reatividade
brônquica, a deposição de colágeno, a hiperplasia das células caliciformes e a produção de muco.
Nossos resultados indicam que o tratamento com sangue autólogo influenciou o recrutamento de
eosinófilos para os pulmões e a hiper-reatividade brônquica.
Observamos ainda que tanto o sangue
autólogo total quanto as hemácias diminuíram o recrutamento de eosinófilos para os pulmões, a
concentração de citocinas Th2, a produção de muco e a deposição de colágeno nos pulmões dos
animais desafiados com OVA. Portanto podemos concluir que o
uso do sangue autólogo e da sua
fração de hemácias influencia os principais parâmetros
inflamatórios da asma, sendo necessário agora
elucidar os possíveis mecanismos anti-inflamatórios decorrentes da hemoterapia.
IX
ABSTRACT
VIEIRA, Joyce Nunes. Study of hemotherapy in allergic asthma model induced by ovalbumin
(OVA) in mice. Rio de Janeiro, 2015. Dissertação (Mestrado em
Ciências Biológicas - Microbiologia)
Instituto de Microbiologia Paulo de Góes - IMPG, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de
Janeiro, 2015.
Hemotherapy is an ancient treatment, with low cost that consists in removing blood from a
patient and its intramuscular re-application. This treatment had been used on a wide variety of diseases
and conditions with several reports of improvements. However, therapeutic efficacy studies have not
been performed. We choose the allergic asthma model induced by ovalbumin (OVA) in mice to study
the effects of hemotherapy. Asthma is a respiratory disease that affects 300 million people all over the
world and its main signs and symptoms are coughing, wheezing and shortness of breath. It is
characterized by airway inflammation and obstruction, bronchial hyperreactivity to various stimuli.
Asthma is an inflammatory disease, led by a Th2 response with the involvement of various cells types
of innate and adaptative response, and eosinophils are considered the most important cells in asthma
pathogenesis. The aim of this study was to analyze the putative therapeutic effect of blood injected
intramuscularly in a asthma model induced by ovalbumina (OVA) in mice. Balb/C mice were
sensitized twice with intraperitoneal injections of OVA using aluminum hidroxio (Al(OH)3) or saline
and challenged 6 times intranasally with OVA. Between the
challenges mice were injected 4 times
intramuscularly with saline, blood or its fractions (plasma and erythrocytes). After treatment we
evaluated the following inflammatory parameters, lymphocyte
recruitment, concentration of Th2
citokynes (IL-4, IL-5, IL-13), bronchial hyperreactivity, collagen deposition, hyperplasia of Goblet
cells and mucus production. Ours results indicated that autologus blood influenced the eosinophil
recruitment to the lungs and the bronchial hyperreactivity. Analyzing the influence of blood fractions,
we observed that total blood and erythrocytes decreased eosinophil recruitment, Th2 citokynes , mucus
production and collagen deposition in OVA challenged mice. Thus we can conclude that treatment
with autologus blood and erythrocytes influence inflammatory parameters of asthma, and is necessary
to elucidate the possible anti-inflammatory mechanisms resulting from hemotherapy.
12
1. INTRODUÇÃO
1.1.A hemoterapia
1.1.2. Definição
De acordo com Houaiss e Vilar (2001) a hemoterapia é um
procedimento terapêutico
antigo que consiste na retirada de uma determinada quantidade de sangue de um indivíduo, e sua
imediata reinjeção. Também é conhecida como terapia do soro, imunoterapia ou hemotransfusão
(Mettenleiter, 1936). Foram descritos quatro tipos distintos de
hemoterapia: Tampão sanguíneo
peridural, hemoterapia ocular ou subconjuntival, hemoterapia com adição de agentes e
hemoterapia propriamente dita ou clássica (Pedrosa et al., 1996;
Lenkiewicz et al., 1992; Rosales
et al., 2005; Geovanni e Noberto , 2009). O Tampão sanguíneo peridural consiste na injeção de
sangue autólogo no espaço peridural para tratar cefaléia refratária após anestesia raquidiana e é
descrito como sendo capaz de evitar o vazamento do líquido
cefalorraquidiano (Amorim e
Valença, 2008). A hemoterapia ocular ou subconjuntival consiste na retirada do sangue fresco e
sua reaplicação no globo ocular, junto com vasodilatadores.
Lenkiewicz e colaboradores (1992)
mostraram em um trabalho com pacientes com queimadura
oculares que a hemoterapia foi o
melhor tratamento para a cicatrização dessas lesões. A
Hemoterapia com adição de agentes utiliza
o sangue basicamente como um veículo. Os agentes adicionados ao sangue podem ser fármacos ou
ozônio (O₃), sendo o ultimo já utilizado no tratamento de diversas doenças como asma, doença
arterial, infecções bacterianas e virais. Na ozonioterapia, o ozônio é
misturado ao sangue e pode
ser administrada de duas maneiras, intravenosa, chamada AHT
Major, ou por infiltração ou
intramuscular, denominada AHT Minor (Gracer e Bocci, 2005;
Rosales et al., 2005; Elvis e Ekta,
2011). A Hemoterapia propriamente dita ou clássica consiste na retirada do sangue venoso do
paciente na sua imediata injeção (Figura 1). Há diferentes métodos de aplicação da hemoterapia,
intramuscular com sangue desfibrinado, intramuscular com sangue fresco ou estocado no gelo, e
de maneira intradérmica de sangue fresco. A quantidade de
sangue aplicado varia de 5mL a 10mL
e a quantidade de injeções depende da gravidade da doença. Tais aplicações podem ser feitas nos
músculos ventroglúteos, glúteos máximo e mínimo, alternando as regiões de aplicação. Esses
procedimentos podem oferecer riscos referentes às punções
intravenosas e injeções
intramusculares, como lesões nos vasos e nervos, hematomas,
necrose tecidual e flebites
(Mettenleitter, 1936; Geovanini e Norberto, 2009).
13
Figura 1 – Esquema mostrando o procedimento da hemoterapia propriamente dita. O sangue é retirado da
prega do cotovelo do indivíduo e injetado em seguida de maneira intramuscular. Imagem retirada de
https://mariliaescobar.wordpress.com/2012/11/16/auto-
hemoterapia-em-animais/.
1.1.3. História
O médico francês Francois Ravaut, em 1911, foi o responsável pelo primeiro registro
científico deste tratamento, utilizado inicialmente em enfermidades como febre tifóide, alguns
tipos de dermatoses e asma, e estados anafiláticos. Essa terapia foi amplamente utilizada,
principalmente na Europa, até década de 50, entrando em
decadência com a descoberta e
administração da penicilina (Mettenlleiter, 1936; Teixeira, 1940).
Mettenleitter (1940) demonstrou, ao provocar uma bolha na coxa de seus pacientes com
cantártida, uma substância irritante, que a aplicação de sangue autólogo aumentava a proporção de
macrófagos no local dos 5% encontrados normalmente antes das injeções, para 22%, indicando
que o tratamento ativaria o sistema fagocítico mononuclear. Silva (2009) também observou, em
experimentos com modelo de lesões cutâneas em ratos Wistar,
que as injeções com sangue
aumentam significantemente a leucometria e otimizam o processo de cicatrização, mostrando uma
14
área de cicatrização mais plana, de bordas regulares e cicatriz
quase imperceptível. Estudos
posteriores com o objetivo de avaliar as concentrações de citocinas e o recrutamento leucocitário
mostraram que ratos Wistar tratados com o próprio sangue
apresentam concentrações aumentadas
de Interleucina 12 (IL-12), Interferon Gama (IFN-γ) e o Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α),
indicando o potencial imunomodulatório da hemoterapia (Cáo et al., 2007; Liang e Jiang, 2012).
A hemoterapia, mesmo não sendo um tratamento clínico aprovado para uso em humanos, é
amplamente utilizada pela clínica veterinária, sozinha ou associada a outras medicações. No
tratamento de tumor venéreo, transmissível em cães, o uso do sangue autólogo resultou no
aumento dos parâmetros hematológicos (linfócitos, monócitos, hemácias, hematócritos, plaquetas
e segmentados) e na diminuição dos tumores e da secreção
sanguinolenta. O uso do sangue em
equinos, depois da retirada dos testículos, diminuiu a freqüência de animais apresentando
complicações infecciosas e melhorou a cicatrização desses animais (Souza, 2009; Escodro, 2012;
Spada, 2013).
1.1.4. A hemoterapia em condições alérgicas e pulmonares
O maior estudo realizado acerca do uso da autohemoterapia foi publicado pelo Dr. Jessé Teixeira,
na Revista Brasil cirúrgico, em 1940. O estudo relata os efeitos do uso do sangue autólogo no
tratamento de complicações pulmonares pós-cirúrgicas em 150
pacientes do Hospital Santa Casa
de Misericórdia do Rio de Janeiro. Os pacientes receberam duas injeções de 10 mL de sangue
intramuscular, a primeira logo após a cirurgia e a segunda 5 dias depois. Ao final do tratamento
nenhum paciente apresentou qualquer complicação infecciosa
(Teixeira, 1940). Maddox e Back
(1936) estudaram o efeito da hemoterapia em 24 pacientes
asmáticos e observaram que 75% dos
indivíduos apresentaram diminuição dos sintomas e do número de crises, especialmente pacientes
abaixo dos 10 anos de idade. Um estudo mais recente usando a hemoterapia combinada ao ozônio
(ozônioterapia) realizado em 113 pacientes asmáticos mostrou,
após três injeções, que a terapia
diminuiu os níveis de IgE séricos, da expressão de HLA-DR por células mononucleares do sangue
periférico e de marcadores antioxidantes da via da glutationa nas hemácias desses pacientes,
indicando um efeito imunomodulatório deste tratamento na asma (Rosales et al, 2005).
15
1.1.5. A polêmica do uso da hemoterapia
Embora o uso da hemoterapia tenha um histórico de relatos que sugerem efeitos favoráveis
evitando complicações pulmonares pós-cirúrgicas, melhorando o processo de cicatrização e
reduzindo os sinais e sintomas de uma série de doenças
inflamatórias (dermatites, asma juvenil,
herpes zoster, rinite alérgica, artrite reumatóide, diabetes mellitus tipo 2, psoríase), a sua eficácia e
os mecanismos de ação são vastamente desconhecidos (Maddox
e Back, 1936; Olwin; Ratajczak;
House, 1997; Ramirez, 2000; Rosales et al., 2005). A legislação brasileira diz que apenas médicos
hematologistas ou especialistas em hemoterapia podem realizar a técnica. Entretanto, em função
da falta de trabalhos científicos comprovando a eficácia do uso do sangue autólogo, o Conselho
Federal de Medicina não reconhece este procedimento como
tratamento médico e a Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) considera a hemoterapia um risco à saúde. Os
defensores da hemoterapia, mesmo reconhecendo a falta de
respaldo científico, afirmam que o
tratamento seria eficaz, sendo utilizado por muitos pacientes, em patologias diversas incluindo
doenças inflamatórias, câncer e dores crônicas. Isso aponta para a necessidade de estudos
sistemáticos, com o uso de modelos inflamatórios adequadamente controlados para avaliação dos
seus efeitos e para a elucidação dos mecanismos envolvidos.
1.2. A asma
1.2.1. Epidemiologia
De acordo com a World Health Organization (WHO), a asma é uma doença respiratória
que afeta cerca de 334 milhões de pessoas em todo o mundo,
principalmente nos países em
desenvolvimento como o Brasil (Figura 2). Seus principais sinais e sintomas são tosse, sibilos e
falta de ar, porém em muitos casos os sintomas são inexistentes até a fase crônica da doença. A
fisiopatologia da asma é complexa, e indivíduos diferentes
apresentam quadros clínicos distintos.
Os motivos para tais disparidades ainda não estão completamente esclarecidos, mas parecem
estar ligados a pré-disposição genética, alimentação, estilo de vida e doenças pré-existentes
(Wenzel, 2012).
16
Figura 2 – Mapa epidemiológico da distribuição dos indivíduos asmáticos ao redor do globo. As maiores
concentrações de indivíduos asmáticos estão nas Américas do Sul e do Norte e Oceania (WHO, 2004).
1.2.2. Subtipos de asma
A Asma é influenciada por fatores genéticos e ambientais, e
apresenta fenótipos
relacionados a fatores como a idade do início da doença, respostas a tratamentos e tipo de resposta
inflamatória desenvolvida. Os fenótipos conhecidos são de cunho alérgico precoce e tardio
(atópico), neutrofílico (não-atópico), relacionado à obesidade e
induzido por exercício (Murdoch,
2010; Wenzel, 2012, Zhang et al., 2013). A maior parte dos
pacientes apresenta a asma alérgica
precoce, com os primeiros sintomas ainda na infância e
normalmente associada a outras doenças
de cunho alérgico como a rinite e dermatite atópica (Wenzel, 2012). A asma atópica tardia
usualmente se desenvolve após os 20 anos de idade, é o tipo mais severo de asma, com crises mais
fortes e mais freqüentes, e os indivíduos normalmente apresentam resistência ao tratamento com
corticosteróides (Wenzel, 2012). A asma induzida por exercícios e relacionada à obesidade atinge
adultos, e se apresenta de forma moderada. O tratamento também é feito com corticosteróides,
broncodilatadores, ou modificadores de leucotrienos (Wenzel, 2012). A asma não-eosinofilica
(NEA) ou não-atópica é caracterizada pelo influxo de neutrófilos,
mastócitos e macrófagos para os
pulmões. (Zhang et al., 2013). Os casos mais severos de asma são encontrados em pacientes
adultos com asma atópica que apresentam além da eosinofilia, a neutrofilia. Em sua fisiopatologia
17
há a participação de diversas células e mediadores inflamatórios do sistema imune inato e
adaptativo (Williams et al., 2012).
1.2.3. A asma alérgica
A asma alérgica é uma doença crônica, caracterizada por altos níveis de IgE, influxo
leucocitário, hiper-reatividade e obstrução reversível das vias aéreas, e pelo aumento da produção
de muco pelas células caliciformes (Bousquet et al, 2000; Nials e Uddin, 2008). De cunho
inflamatório, é dirigida por uma resposta Th2 com a participação de células do sistema inume
inato e adaptativo, como macrófagos aleveolares, células
dendríticas, mastócitos, basófilos,
neutrófilos, NKT (natural killer T), linfócitos inatos, linfócitos T
CD4+. No entanto, os
eosinófilos são células chave na patogênese da asma (Nakagome e Nagata, 2011, Halim et al.,
2012). Diversos mediadores inflamatórios e citocinas tem papel importante em promover
infiltrado celular e inflamação nas vias aéreas, e remodelamento tecidual, especialmente as
citocinas IL-4, IL-5 e IL-13 (Lai et al, 2008; Williams et al, 2012).
1.2.4. A resposta Th2 na asma alérgica
O processo inflamatório na asma é iniciado a partir do contato com alérgenos como ácaros
de poeira doméstica, pólen, produtos químicos, fumaça, entre outros, porém apenas alguns
indivíduos sensibilizados desenvolvem a doença. As causas para essa pré-disposição ainda são
desconhecidas, embora algumas hipóteses tenham sido propostas na tentativa de explicar tal
heterogeneidade, como a influencia de infecções virais e
bacterianas sobre o epitélio pulmonar e
polimorfismos em genes-alvo. Contudo mais estudos são
necessários para se determinar a
contribuição relativa de cada um desses componentes (Holgate et al, 2010; Locksley, 2010).
Existem 3 estágios da resposta Th2 na asma alérgica, a fase de sensibilização, fase aguda e
fase crônica da doença. Na fase de sensibilização o indivíduo tem o primeiro contato com o
alérgeno, secretando anticorpos específicos. A fase aguda se iniciará após o segundo contato com
o alérgeno e a fase crônica é resultado do contato contínuo, e é
caracterizada pelo remodelamento
das vias aéreas (Magalhães et al., 2007; Nials et al., 2008;
Locksley, 2010).
18
1.2.4.1.A fase de sensibilização
O epitélio pulmonar é uma importante barreira física, com grande capacidade de
regeneração tecidual, porém já foi visto em adultos asmáticos que essa regeneração é prejudicada.
Infecções, poluentes e o contato com outros alérgenos como o ácaro de poeira doméstica podem
causar lesões no epitélio, iniciando um sinal de dano, ativando receptores da imunidade inata das
células epiteliais, os receptores de reconhecimento padrão (PRRs).
Uma vez ativadas, as células
epiteliais secretam quimiocinas e citocinas, como CCL20, CCL27, recrutando células dendríticas
imaturas para a mucosa. O epitélio secreta também TSLP, IL-25 e IL-33, essenciais para o
recrutamento e maturação de células dendríticas e outras células da imunidade inata, como as
células NKT, natural helper, eosinófilos, mastócitos e basófilos.
Essas células são essenciais para
a resposta alérgica, pois além de expressarem moléculas MHC
classe II e moléculas coestimulatórias
secretam altas concentrações de citocinas Th2 como IL-4, IL-5 e IL-13, importantes
para o inicio e manutenção da resposta inflamatória (Figura 3)
(Holgate et al., 2010; Kim et al.,
2010).
As células apresentadoras de antígenos ativadas, especialmente as células dendríticas
fazem a interface entre a resposta imune inata e a resposta
adaptativa. Essas células capturam e
processam o alérgeno, migrando para os linfonodos drenantes e apresentando seus peptídeos, via
MHC II a linfócitos T CD4+ virgens. Juntamente com citocinas como a IL-4, possivelmente
secretadas por basófilos, mastócitos, células T CD4+ virgens se diferenciam em linfócitos Th2
secretando as citocinas Th2 IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13 e GM-CSF.
A IL-4 juntamente com IL-
13 são essenciais para a indução da mudança de classe e
secreção de IgE por plasmócitos. Essas
imunoglobulinas se ligam com alta afinidade a receptores na
superfície de basófilos ou mastócitos
e esse indivíduo estará sensibilizado (Figura 4)(Barret e Austen, 2009).
19
FIGURA 3 - A resposta imune inata na asma alérgica. O contato com o alérgeno com o epitélio pulmonar
iniciará a resposta alérgica na asma. As células epiteliais
reconhecem por receptores de reconhecimento
padrão (PRR) o alérgeno, secretando diversas citocinas e
quimiocinas, especialmente IL-25, IL-33 e TSLP,
que irão recrutar células do sistema imune inato como mastócitos, basófilos, eosinófilos, células NKT,
células natural helper, macrófagos e células dendríticas. Essas células por expressarem moléculas MHC
classe II e secretarem citocinas Th2, como IL-4, IL-5 e IL-13 são essenciais para o inicio e manutenção da
resposta Th2 decorrente da asma. Esquema modificado (Hammad
e Lambrecht, 2008).
1.2.4.2. As fases aguda e crônica
Os mastócitos e basófilos revestidos por imunoglobulinas em um segundo contato com o
alérgeno degranulam e liberam mediadores lipídicos (leucotrienos, prostaglandinas), fatores de
crescimento, quimiocinas e citocinas (IL-4, IL-13, IL-12, TNF-α, entre outros), estimulando o
influxo de células inflamatórias (Marshall, 2004). Outra célula essencial na fase aguda da doença é
o eosinófilo, um granulócito que se desenvolve na medula óssea a partir do progenitor CD34+, e
sobre estímulo das citocinas IL-3, GM-CSF e principalmente IL-5
amadurecem, saindo da medula
óssea para o sítio de inflamação. A IL-5, junto com a eotaxina e
RANTES, liberada pelas células
epiteliais pulmonares, é responsável pelo recrutamento,
proliferação, maturação e sobrevivência
dos eosinófilos. Ativadas, essas células liberam seus grânulos contendo proteínas catiônicas
básicas (PCB), peroxidase eosinofílica (PE), que levarão a lesões teciduais, e mais quimiocinas e
20
citocinas (IL-4, IL5, IL-13), estimulando o influxo leucocitário, mantendo e amplificando o ciclo
da resposta inflamatória (Rosenberg et al., 2007; Holgate e Polosa, 2008; Stone et al., 2010).
A constante exposição ao antígeno acarretará na fase crônica da doença. Os medidores
inflamatórios liberados por mastócitos e eosinófilos, e as citocinas IL-5 e IL-13 são essenciais
nessa fase, pois irão estimular a deposição de colágeno,
hiperplasia das células caliciformes,
espessamento do músculo liso e a diferenciação de fibroblastos. O
contato contínuo com o
alérgeno e o influxo leucocitário, especialmente de eosinófilos, resultará no remodelamento das
vias aéreas (Figura 4) (Holgate et al, 2010; Murdoch e Lloyd, 2010;
Sokol e Medzhitov, 2010;
Nakagome e Nagata, 2011; Deckers et al, 2013).
21
Figura 4 – Resposta Th2 na asma alérgica. A resposta inflamatória é iniciada a partir do reconhecimento
do alérgeno pelo epitélio pulmonar. Células apresentadoras de antígeno reconhecem esse antígeno, o
clivam e apresentam seus peptídeos via MHC II a células T
virgens, que se diferenciam em células Th2,
liberando citocinas como IL-4, IL-5 e IL-13. As citocinas IL-4 e IL-13
irão estimular a mudança de classe e
secreção de IgE pelas células B. Essas imunoglobulinas
específicas se ligam à receptores FcεRI na
superfície de mastócitos com alta afinidade. No segundo contato o alérgeno se liga a esses receptores,
ativando essas células, que irão degranular, liberando mediadores como histaminas, leucotrienos (LTB4),
prostaglandinas e citocinas, iniciando a resposta aguda ao
alérgeno. A citocina IL-5 liberada é essencial no
recrutamento, proliferação, maturação, ativação e sobrevivência dos eosinófilos, que ativados liberam mais
mediadores como proteínas básicas e mais citocinas. O contato contínuo com o alérgeno resultará na fase
crônica da doença, caracterizada pelo espessamento do músculo liso, ativação dos fibroblastos, depósito de
colágeno, angiogênese e aumento da produção de muco, cujas
citocinas IL-13 e IL-5 tem papel essencial.
Esquema modificado (Holgate e Polosa, 2008).
1.2.5. Tratamentos
Os tratamentos variam de paciente para paciente, e a associação de corticosteróides e
broncodilatadores ainda são os mais utilizados por possuírem ação clínica satisfatória, porém
mostram efeitos colaterais significativos e casos freqüentes de resistência. Mais recentemente,
foram desenvolvidos tratamentos baseados na modulação de
moléculas alvo da resposta alérgica,
como bloqueadores da cadeia alfa do receptor de IL-4
(Dupilumab), anti-IL-13 (Lebrikizumab) e
anticorpos anti-IgE, a exemplo do Omalizumabe, já aprovado para uso clínico. Embora esses
22
anticorpos diminuam a inflamação e melhorem a função pulmonar, tais tratamentos são
administrados juntamente com o uso dos corticosteróides. O anti-
IL-5 Mepolizumab, por levar a
redução do numero de eosinófilos, leva a diminuição da resposta inflamatória e da deposição de
matriz extracelular. De forma similar o anticorpo que bloqueia o receptor de IL-5 parece melhorar
a inflamação por meses após uma única injeção (Wenzel, 2012;
Lambrecht e Hammad, 2015).
1.2.6. Modelos animais na asma alérgica
Os modelos animais de asma têm sido muito utilizados para maior compreensão sobre os
mecanismos fisiopatológicos e para o desenvolvimento de
estratégias terapêuticas. Diversos
modelos animais já foram utilizados como ratos, cobaias,
cachorros, furões, cavalos, macacos,
ovelhas e camundongos, porém a maioria dos estudos foi feita em ratos e camundongos. Embora
camundongos não apresentem exatamente a asma como em
humanos, é possível reproduzir e
estudar diversas dessas características, como o influxo de células inflamatórias, a hiperreatividade
brônquica e o remodelamento tecidual (Halwani et al., 2010). Os principais modelos de asma são
realizados em camundongos da cepa Balb/C devido ao bom
desenvolvimento da resposta Th2. Os
protocolos mais utilizados para o desenvolvimento da resposta em camundongos são com
sensibilizações e desafios com os antígenos como o extrato do ácaro de poeira doméstica
Dermatophagoides pteronissynus (HDM) ou o antígeno derivado
da clara do ovo, ovalbumina
(OVA). No caso do modelo da OVA as sensibilizações são feitas
junto com adjuvantes como o
hidróxio de alumínio, importantes para promover o
desenvolvimento da resposta Th2 (Nials e
Uddin, 2008). O modelo de asma induzida por OVA não representa todos os tipos de asma, porém
mostra diversos aspectos inflamatórios da doença alérgica,
especialmente os altos níveis de IgE,
IL-4, IL-5 e IL-13, e hiper-reatividade brônquica, sendo um modelo importante no estudo da
fisiopatologia da doença (Kim et al., 2010).
23
2. HIPÓTESE
O uso do sangue autólogo tem efeitos terapêuticos em um modelo experimental de asma
alérgica.
3. OBJETIVOS
Objetivo Geral
Estudar os possíveis efeitos terapêuticos da hemoterapia no
modelo de asma induzida por
OVA em camundongos.
Objetivos Específicos
Analisar se o uso do sangue autólogo tem efeitos sobre os
principais parâmetros da asma
alérgica: a resposta inflamatória (recrutamento celular e secreção de citocinas Th2 como
IL-4, IL-5 e IL-13), a hiper-reatividade brônquica, hiperplasia das células de caliciformes e
secreção de muco, depósito de colágeno e os níveis de IgE
plasmáticos;
Utilizar fracionamento do sangue (plasma e hemácias) para
estabelecer a contribuição de
cada um dos seus componentes no modelo de asma alérgica.
24
4. METODOLOGIA
4.1. Desenho experimental
Foram utilizados camundongos Balb/C, fêmeas, com idades de 6-8
semanas. Em todos os
experimentos, os animais foram sensibilizados com duas injeções intraperitoneais (i.p) de OVA
Sigma (100μg/animal) em Hidróxio de Alumínio (1,6mg/animal), com intervalo de 7 dias entre a
primeira e a segunda injeção. Uma semana depois, iniciou-se uma sequencia de 6 desafios
intranasais (i.n) com OVA (10μg/animal) com intervalos de 2 a 3
dias. Este protocolo foi baseado
no estudo de Lintomen e colaboradores (2008). Após dois desafios com OVA ou salina iniciamos
uma sequência de 4 injeções intramusculares (i.m) com 10μL de sangue autólogo total ou de suas
frações ao longo de 2 semanas. No 32° dia, 24 horas após o ultimo desafio, os animais foram
anestesiados e eutanasiados para coleta de sangue, lavado
broncoalveolar (BAL), pulmões,
quadríceps e medula óssea (Figura 5).
FIGURA 5 – Desenho experimental do tratamento.
25
4.2. Retirada e Injeções intramusculares de sangue ou de suas frações
Uma vez que os animais da cepa Balb/C são isogênicos, utilizamos animais doadores do
mesmo sexo e idade para coleta de sangue para as injeções.
Foram retirados 200μL do plexo
ocular dos animais doadores com tubos capilares heparinizados (Glassyto). O sangue total retirado
foi imediatamente injetado no quadríceps dos animais, alternando entre a pata direita e esquerda
ao longo das injeções para evitar maiores lesões teciduais. Após a injeção de 10 μL sangue total o
sobressalente foi centrifugado por 7 minutos a 10000 rpm para separação das frações. Após a
centrifugação, 10μL de plasma ou hemácias foram aplicados nos quadríceps dos animais. Pouca
heparina foi utilizada e as injeções foram feitas rapidamente para evitar coagulação. As
quantidades de sangue ou de suas frações utilizadas foram
padronizadas baseadas no tratamento
realizado em humanos, além de considerar a quantidade média de sangue corporal.
4.3. Animais e grupos
Os animais foram mantidos no biotério do Laboratório de
Inflamação e Imunidade, em
ambiente com temperatura e ciclo claro-escuro controlados, e acesso irrestrito a água e ração. Nos
primeiros experimentos para a análise dos efeitos da hemoterapia, todos os animais foram
sensibilizados com injeções intraperitoneais de OVA e divididos em 4 grupos:
O primeiro grupo foi dos animais usados como controle negativo, desafiados com
salina estéril intranasal e com injeções intramusculares de salina estéril;
O segundo grupo foi formado com animais desafiados com salina estéril intranasal
e injetados com sangue próprio;
O terceiro grupo é o controle positivo, com animais desafiados com OVA
intranasal e injetados com salina estéril;
Os animais do quarto e último grupo foram desafiados com OVA
intranasal e
tratados com injeções intramuscultares de sangue próprio.
Em experimentos posteriores para estudar os efeitos de cada
fração do sangue, todos os
animais também foram sensibilizados com injeções de OVA i.p
sendo formados então os
seguintes grupos:
Controle negativo, com animais desafiados com salina estéril intranasal e injetados
com salina estéril intramuscular;
26
Controle positivo, com animais desafiados com OVA intranasal e injetados com
salina estéril intramuscular;
O grupo com animais desafiados com OVA intranasal e tratados com injeções de
sangue total;
O grupo de animais desafiados com OVA intranasal e com injeções com plasma
intramusculares;
Ultimo grupo desafiado com OVA intranasal e com injeções
intramusculares de
hemácias.
4.4. Coleta das amostras
Antes do sacrifício dos animais, retiramos uma gota de sangue da cauda para montagem
das lâminas de esfregaço e mais 5μL para contagem total de células na câmara de Neubauer. Os
animais foram anestesiados e sacrificados com isofluorano inalado para coleta de sangue e
canulação para a lavagem broncoalveolar com 1,2 mL de salina estéril. Retiramos os pulmões,
separamos o lobo esquerdo para ELISA, e o lobo direito foi
colocado em 5mL de 10%
Formol/PBS para histologia. As colorações de hematoxilina-eosina (HE), Picrosirius e PAS foram
realizadas para analisar o infiltrado celular, deposição de colágeno e a produção de muco nos
pulmões, respectivamente.
A medula óssea do fêmur da pata injetada por ultimo com salina, sangue ou suas frações
foi retirada e lavada com 2 mL de salina estéril para retirada de células. Após montagem da
câmara de Neubauer para contagem total, as amostras foram
centrifugadas por 10mins a
14000rpm e o sobrenadante foi coletado e estocado a -20oC para posterior dosagem de citocinas
por ELISA. O sangue coletado foi centrifugado por 7 minutos a 10000rpm e o BAL por 10
minutos a 500G. Em seguida, o plasma e o sobrenadante do BAL
foram aliquotados e estocados a
-20oC para posterior dosagem de IgE e de citocinas por ELISA.
Paralelamente, o sedimento do
BAL foi ressuspendido em 200 μL de salina para contagem total e diferencial das células.
4.5. Contagem celular total e diferencial
A contagem do número de células total do BAL, sangue e medula óssea foi realizada na
câmara de Neubauer, com a diluição de 1:20 em solução de
corante líquido de Turk (solução de
violeta gensiana e ácido acético 2%). Para a contagem diferencial, o sedmento do BAL
27
ressuspendido em salina e as células lavadas da medula óssea foram centrifugadas por 5 minutos
(CITOCENTRÍFUGA DAMON/IEC Division) e coradas com panótico
rápido (Laborclin® ref.
620529). Utilizando o microscópio óptico OLYMPUS BX40 acoplado a um monitor, as células
foram identificadas com base nas suas características
morfológicas, sendo classificadas em
mononucleares, eosinófilos e neutrófilos. Foi utilizada a lente objetiva no aumento de 100X com
óleo de imersão para microscópio (Merck®, lote HX118077), e as
lâminas foram contadas por três
vezes, utilizando a média aproximada como resultado.
4.6. Quantificação de citocinas
As concentrações de IgE e de citocinas foram determinadas pelos testes de ELISA
(Peprotech®), a partir de amostras BAL e extrato pulmonar. As
placas foram cobertas com 100μL
por poço com os anticorpos de captura. Posteriormente foram
lavadas com PBS/Tween 0,05% por
3 vezes e bloqueadas com 300μL por poço de PBS/BSA 1% por 1
hora, também a temperatura
ambiente. Lavamos por 3 vezes com PBS/Tween 0,05%, aplicando 100μL dos padrões com
diluições seriadas (1:2), além das amostras. As placas foram incubadas na geladeira por 24 horas.
Lavamos 3 vezes com PBS/Tween 0,05%, incubando as placas por 2 horas com 100μL por poço
do anticorpo de detecção a temperatura ambiente. Lavamos 4
vezes com PBS/Tween 0,05%,
incubando as placas com 100μL de estreptoavidina (1:4000) por 30
minutos a temperatura
ambiente, no escuro, lavando mais 4 vezes com PBS/Tween
0,05%. Adicionamos para revelação
100μL de uma solução de TMB 1% (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina)
em DMSO (Dimetil sufóxido),
peróxido de hidrogênio (H2O2) e tampão citrato fosfato, incubando as placas no escuro por até 15
minutos, dependendo da intensidade da cor. A leitura foi realizada no espectofotômetro a um
comprimento de onda de 450nm. As concentrações dos anticorpos de captura e detecção e dos
pontos das curvas padrões variaram de acordo com as citocinas (Tabela 1).
Citocinas Curva Padrão Anticorpo de
captura
Anticorpo de
detecção
IL-4 (kit n°900-K49,
lote #0708049)
2000 a 16pg/ml 1μg/ml 1μg/ml
IL-5 (kit n°900-K406,
lote #1111406)
2000 a 32pg/ml 1μg/ml 0,5μg/ml
IL-13 (kit n°900-
K207, lote #1009207)
1000 a 16pg/ml 0,5μg/ml 0,5μg/ml
Tabela 1 – Concentrações respectivas ao kits Peprotech® das citocinas IL-4, IL-5 e IL-13.
28
4.7. Histologia
Os tecidos foram retirados dos animais e colocados em seguida em 10% Formol/PBS.
Após 48 horas foram transferidos para álcool 70%.
4.7.1. Processamento
Os pulmões e músculos foram cortados de forma longitudinal e colocados em cassetes.
Imediatamente foi feita a desidratação em banhos com uma bateria crescente de álcool: 80%;
95%; 100%; 100%. Posteriormente os tecidos foram clarificados com 2 banhos de xilol. Cada
banho com duração de 30 minutos.
4.7.2. Inclusão em Parafina e microtomia
Após a clarificação os tecidos passaram por 2 banhos de parafina a 50°C, de 1 hora cada,
sendo incluídos então em blocos de parafina. Após inclusão os blocos foram cortados no
micrótomo com cortes de 5mm de espessura e colocados em
lâminas.
4.7.3. Desparafinização e Reidratação
Antes das colorações os cortes foram desparafinizados em 2
banhos de xilol, de 1 minuto
cada. Imediatamente foram então reidratados com 2 banhos de
álcool 100% e 1 banho de álcool
70%, 5 minutos cada. Após o ultimo banho de álcool os cortes passaram por um banho de água
mili-Q de 15 a 20 minutos.
4.8. Colorações
4.8.1. Hematoxilina-eosina (HE)
Para análise do infiltrado inflamatório nos pulmões fizemos a coloração de HE. As lâminas
foram coradas com Eosina e Hematoxilina de Harris (Sigma), de acordo com o protocolo do
Laboratório Multidisciplinar do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho - UFRJ.
4.8.2. Picrosirius
Para analisar a deposição de colágeno ao redor de brônquios e vasos coramos as lâminas
com picrosirius. As lâminas foram coradas com ácido pícrico (2,4,6-
trinitrofenol), de acordo com
o protocolo do Laboratório Multidisciplinar do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho -
UFRJ.
29
4.8.3. Periodic acid-Schiff (PAS)
Para marcar as células caliciformes e muco, as lâminas foram coradas com reagente de
Schifft previamente preparado, de acordo com o protocolo do
Laboratório Multidisciplinar do
Hospital Universitário Clementino Fraga Filho - UFRJ.
4.8.4. Desidratação e montagem de lâminas
Após as colorações as lâminas foram desidratadas e clarificadas com banhos em uma
bateria de álcool 70%, 100%, 100%, 100%, e com 3 banhos de
xilol, todos de aproximadamente 1
minuto. Por fim as lâminas foram montadas com Entellan (Sigma).
4.9. Quantificação de colágeno
Após a coloração com Picrosirius as fibras colágenas foram
quantificadas pelo programa
Image-Pro Plus Demo. O programa compara foto a foto padrões de pixels previamente fixados,
tanto para área total das fotos, quanto para área de fibras
colágenas coradas em vermelho, gerando
valores numéricos para cada foto.
4.10. Quantificação de muco
Para quantificação do muco, observamos no microscópio óptico células coradas com PAS.
A partir das células PAS+ fizemos um score semi-quantitativo, duplo-cego para cada animal.
Usamos um score com cinco pontuações diferentes, de acordo
com o número de células coradas
por brônquio. Score semi-quantitativo: 0 – 0%; 1 – 0 a 25%; 2 –
25% a 50%; 3 – 50% a 75%; 4 –
75% a 100 (Trifilieff et al, 2000). As pontuações foram dadas para cada brônquio, sendo somadas
e divididas pelo número de brônquios analisados (10-20 brônquios por animal).
4.11. Análise estatística
Os gráficos das contagens total e diferencial e dos testes de ELISA
foram criados com o
uso do programa Graph Prim 5.0, assim como as análises
estatísticas. O teste estatístico utilizado
foi teste t (e não paramétrico), comparando os grupos 2 a 2, considerando resultados com p<0,05
significativos estatisticamente.
30
5. RESULTADOS
5.1. O uso do sangue autólogo influencia o recrutamento celular para os pulmões.
Para estudar os efeitos do uso do sangue autólogo na resposta inflamatória decorrente da
asma, analisamos inicialmente o número de leucócitos no BAL e no sangue dos animais. No BAL,
observamos que os animais alérgicos mostraram um número maior de leucócitos recrutados para
os pulmões do que os animais não desafiados. O maior influxo de leucócitos para os pulmões dos
animais desafiados com OVA mostra a existência de uma resposta inflamatória decorrente dos
desafios com o alérgeno (Figura 7A). O número de células
mononucleares nos animais alérgicos e
tratados com sangue foi maior que no grupo de animais desafiados com salina (Figura 7B). Já o
número de neutrófilos é maior nos dois grupos de animais
desafiados com OVA quando
comparados aos animais não desafiados (Figura 7C). Quando
observamos o recrutamento dos
eosinófilos, animais desafiados com OVA apresentaram números significativamente maiores que
os animais desafiados com salina, como o esperado.
Interessantemente, os animais desafiados com
OVA e tratados com injeções de sangue, apresentaram número de eosinófilos no BAL
significativamente diminuído (Figura 7 D). O tratamento com
sangue, embora tenha diminuído o
recrutamento de eosinófilos não diminuiu o influxo de leucócitos para os pulmões, mostrando a
existência de um processo inflamatório decorrente dos 6 desafios com OVA. As médias
estatísticas geradas estão discriminadas na tabela 2.
Grupos x Grupos SEM (Células x 106/BAL) N
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Salina
i.m
Cél. Total: 0,5740±0,07254 e 2,964±0,2144
Céls. Mono.: 0,5450±0,06921 e 1,031±0,1001
Neutrófilos: 0,0170±0,003350 e 0,0925±0,01740
Eosinófilos: 0,0050±0,002236 e 1,053±0,1749
N=10
N=8
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Sangue
Total i.m
Cél. Total: 0,5740±0,07254 e 2,438±0,3511
Céls. Mono.: 0,5450±0,06921 e 1,123±0,1676
Neutrófilos: 0,0170±0,003350 e 0,1163±0,02815
Eosinófilos: 0,0050±0,002236 e 0,6013±0,05848
N=10
N=8
OVA i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Sangue
Total i.m
Cél. Total: 2,964±0,2144 e 2,438±0,3511
Céls. Mono.: 2,964±0,2144 e 1,123±0,1676
Neutrófilos: 2,964±0,2144 e 1163±0,02815
Eosinófilos: 2,964±0,2144 e 0,6013±0,05848
N=8
N=8
Tabela 2 – Dados da Figura 7, representados em Média±Erro padrão da média (SEM).
31
A) B)
C) D)
FIGURA 7 – Os efeitos da hemoterapia no influxo de células inflamatórias para os pulmões.
Contagem do número de células totais (A), mononucleares (B), neutrófilos (C) e eosinófilos (D) no BAL.
Dados representados como Média±Erro padrão da média (SEM)
de 2 experimentos independentes, com n=
8-10. * representa diferença significativa (P< 0,05) entre dois grupos comparados par a par por teste t.
Salina
Sangue
Salina
Sangue
0
1
2
3
4
Salina OVA
*
*
Nº células x 10 6 / BAL
Salina
Sangue
Salina
Sangue
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Salina OVA
*
N° mononucleares x 10 6 / BAL
Salina
Sangue
Salina
Sangue
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
Salina OVA
*
*
N° neutrófilos x 10 6 / BAL
Salina
Sangue
Salina
Sangue
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Salina OVA
*
* *
N° eosinófilos x 10 6 / BAL
32
5.2. As injeções de sangue influenciaram o número neutrófilos no sangue periférico dos
animais alérgicos tratados com sangue.
A fim de observar se o uso do sangue tem efeito também no
número de leucócitos
circulantes, fizemos esfregaços sanguíneos para contagem
diferencial 24 horas após o ultimo
desafio com OVA. Observamos que a quantidade de leucócitos não foi diferente entre os animais
alérgicos e não alérgicos, assim como o número de células
mononucleares e eosinófilos (Figuras
8A, 8B e 8D). Porém, o número de neutrófilos nos animais
alérgicos tratados com sangue foi
maior que nos animais não desafiados com OVA (Figura 8C).
Esses resultados mostram que o
tratamento com sangue aumenta o recrutamento de neutrófilos
para o BAL e o número de
neutrófilos no sangue, sugerindo que o tratamento influencia no trânsito de neutrófilos, células
com papel ainda pouco claro na asma alérgica. As médias
estatísticas geradas estão discriminadas
na tabela 3.
Grupos x Grupos SEM (Células x 106/mL) N
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Salina
i.m
Cél. Total: 16,86±1,467 e 2,964±0,2144
Céls. Mono.: 11,83±0,9925 e 13,02±1,391
Neutrófilos: 3,848±0,9175 e 2,301±0,5301
Eosinófilos: 1,503±0,3661 e 2,036±0,4915
N=10
N=9
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Sangue
Total i.m
Cél. Total: 16,86±1,467 e 14,76±2,457
Céls. Mono.: 11,83±0,9925 e 9,170±1,477
Neutrófilos: 3,848±0,9175 e 3,879±1,273
Eosinófilos: 1,503±0,3661 e 2,126±0,6510
N=10
N=9
OVA i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Sangue
Total i.m
Cél. Total: 17,21±1,586 e 14,76±2,457
Céls. Mono.: 13,02±1,391 e 9,170±1,477
Neutrófilos: 3,879±1,273 e 3,879±1,273
Eosinófilos: 2,036±0,4915 e 2,126±0,6510
N=9
N=9
Tabela 3 – Dados da Figura 8 representados como Média±Erro padrão da média (SEM).
33
A) B)
C) D)
FIGURA 8 – Os efeitos da hemoterapia no número de leucócitos no sangue. Contagem do número de
células total (A), mononucleares (B), neutrófilos (C) e eosinófilos (D) no sangue periférico 24 horas após o
último desafio com OVA. Dados representados como Média±Erro
padrão da média (SEM) de 2
experimentos independentes, com n= 9-10. * representa diferença significativa (P< 0,05) entre dois grupos
comparados par a par por teste t.
Salina
Sangue
Salina
Sangue
0
10
20
30
Salina OVA
Nº células x 10 6 / mL
Salina
Sangue
Salina
Sangue
0
5
10
15
20
25
Salina OVA
N° mononucleares x 10 6 / mL
Salina
Sangue
Salina
Sangue
0
5
10
15
Salina OVA
*
N° neutrófilos x 10 6 / mL
Salina
Sangue
Salina
Sangue
0
2
4
6
8
Salina OVA
N° eosinófilos x 10 6 / mL
34
5.3. O tratamento com sangue total e com hemácias diminuiu o influxo de células
inflamatórias para os pulmões dos animais desafiados com OVA
Os resultados anteriores mostraram a influência do uso do sangue sobre alguns parâmetros
inflamatórios no modelo de asma experimental. Com isso,
decidimos estudar qual a fração do
sangue estaria desempenhando esse papel. Assim como nos
primeiros experimentos, todos os
animais foram sensibilizados com OVA e passaram por 6 desafios com OVA e 4 injeções
intramusculares de salina, sangue total, plasma ou hemácias. No BAL, todos os animais
desafiados com OVA mostraram maior influxo leucocitário para os pulmões quando comparados
ao grupo salina, mostrando a existência de um processo
inflamatório local resultante dos desafios
com OVA (Figura 9A). Ao realizarmos as contagens diferenciais no BAL para identificar os tipos
celulares recrutados, vimos que o número de células
mononucleares não foi alterado entre os
grupos e, diferente dos experimentos anteriores, o número de neutrófilos foi maior em todos os
grupos de animais asmáticos tratados ou não (Figuras 9 B e 9C).
Analisando o recrutamento de
eosinófilos para os pulmões, vimos que este influxo foi maior nos animais desafiados com OVA
do que nos animais controle desafiados com salina. No entanto, os animais desafiados com OVA e
tratados com sangue total ou hemácias apresentaram um menor
número de eosinófilos em relação
aos animais alérgicos sem tratamento. Por outro lado, o tratamento dos animais com a fração de
plasma livre de células não foi eficaz em reduzir esse recrutamento (Figura 9D).
Baseados nesses resultados, concluímos que apenas o uso do
sangue total e das hemácias
tem um efeito de inibir o influxo das células inflamatórias para os pulmões, uma característica
importante para o inicio e manutenção da resposta Th2
característica da asma.
35
Grupos x Grupos SEM (Células x 106/BAL) N
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Salina
i.m
Cél. Total: 0,700±0,08169 e 2,658±0,3504
Céls. Mono.: 1,500±0,215 e 1,190±0,806
Neutrófilos: 0,3385±0,01238 e
0,1085±0,01395
Eosinófilos: 0,01308±0,006444 e
1,414±0,2299
N=13
N=13
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Sangue
Total i.m
Cél. Total: 0,700±0,08169 e 2,093±0,2672
Céls. Mono.: 1,500±0,215 e 1,218±0,1490
Neutrófilos: 0,3385±0,01238 e
0,1450±0,0186
Eosinófilos: 0,01308±0,006444 e
0,7408±0,1417
N=13
N=12
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Plasma
i.m
Cél. Total: 0,700±0,08169 e 2,040±0,1940
Céls. Mono.: 1,500±0,215 e 1,622±0,1072
Neutrófilos: 0,3385±0,01238 e
0,1789±0,03615
Eosinófilos: 0,01308±0,006444 e
0,9975±0,1662
N=13
N=9
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n +
Hemácias i.m
Cél. Total: 0,700±0,08169 e 2,099±0,3377
Céls. Mono.: 1,500±0,215 e 1,084±0,1727
Neutrófilos: 0,3385±0,01238 e
0,2178±0,05823
Eosinófilos: 0,01308±0,006444 e
0,5550±0,06604
N=13
N=9
OVA i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Sangue
Total i.m
Cél. Total: 2,658±0,3504 e 2,093±0,2672
Céls. Mono.: 1,190±0,1806 e 1,218±0,1490
Neutrófilos: 0,1085±0,01395 e 0,1450±0,0186
Eosinófilos: 1,414±0,2299 e 0,7408±0,1417
N=13
N=12
OVA i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Plasma
i.m
Cél. Total: 2,658±0,3504 e 2,740±0,2029
Céls. Mono.: 2,658±0,3504 e ± 1,622±0,1072
Neutrófilos: 0,1085±0,01395 e 0,1789±0,03615
Eosinófilos: 1,414±0,2299 e 0,9975±0,1662
N=13
N=9
OVA i.n + Salina i.m
versus OVA i.n +
Hemácias i.m
Cél. Total: 2,658±0,3504 e 2,099±0,3377
Céls. Mono.: 2,658±0,3504 e 1,084±0,1727
Neutrófilos: 0,1085±0,01395 e 0,2178±0,05823
Eosinófilos: 1,414±0,2299 e 0,5550±0,06604
N=13
N=9
Tabela 4 – Dados da figura 9 representados como Média±Erro padrão da média (SEM).
36
A) B)
C) D)
FIGURA 9 - Os efeitos da hemoterapia e suas frações no influxo de células inflamatórias para os
pulmões. Contagem do número de células total (A), mononucleares (B), neutrófilos (C) e eosinófilos (D)
no BAL de animais desafiados com OVA ou salina e tratados com sangue intramuscular ou suas fraçoes.
Dados representados como Média±Erro padrão da média (SEM)
de 2 experimentos independentes, com n=
9-13. * representa diferença significativa (P< 0,05) entre dois grupos comparados par a par por teste t.
***Grupo diferente de todos os outros.
Salina
Salina
Sangue Total
Plasma
Hemácias
0
2
4
6
Salina OVA
***
Nº células x 10 6 / BAL
Salina
Salina
Sangue Total
Plasma
Hemácias
0
1
2
3
4
Salina OVA
N° mononucleares x 10 6 / BAL
Salina
Salina
Sangue Total
Plasma
Hemácias
0.0
0.2
0.4
0.6
Salina OVA
***
N° neutrófilos x 10 6 / BAL
*
Salina
Salina
Sangue Total
Plasma
Hemácias
0
1
2
3
4
Salina OVA
*
*
***
N° eosinófilos x 10 6 / BAL
37
5.4. O tratamento com hemácias diminui o número de neutrófilos no sangue dos animais
desafiados com OVA.
A fim de observar se o uso do sangue e suas frações tem efeito também no número de
células inflamatórias no sangue, 24 horas após o ultimo desafio fizemos esfregaços sanguíneos
para contagem diferencial. Vimos que a quantidade total de
leucócitos, de células mononucleares,
e eosinófilos não foram diferentes entre os animais desafiados ou não, porém o número de
neutrófilos estava diminuído no sangue dos animais alérgicos e tratados com hemácias (Figuras
10A - D). Analisando esse parâmetro, apenas o tratamento com hemácias mostrou influência sobre
o número de células no sangue, diferente do tratamento com
sangue total ou plasma.
38
Grupos x Grupos SEM (Células x 106/mL) N
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Salina
i.m
Cél. Total: 18,54±1,368 e 18,36±1,597
Céls. Mono.: 12,51±1,034 e 13,01±1,556
Neutrófilos: 5,282±0,7762 e 4,528±0,6507
Eosinófilos: 0,7638±0,09900 e 0,7585±0,1450
N=13
N=13
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Sangue
Total i.m
Cél. Total: 18,54±1,368 e 19,62±1,715
Céls. Mono.: 12,51±1,034 e 12,13±1,579
Neutrófilos: 5,282±0,7762 e 6,251±0,7904
Eosinófilos: 0,7638±0,09900 e 0,7958±0,1312
N=13
N=12
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Plasma
i.m
Cél. Total: 18,54±1,368 e 18,44±1,841
Céls. Mono.: 12,51±1,034 e 14,66±1,623
Neutrófilos: 5,282±0,7762 e 3,421±0,3361
Eosinófilos: 0,7638±0,09900 e 0,6322±0,1118
N=13
N=9
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n +
Hemácias i.m
Cél. Total: 18,54±1,368 e 20,28±2,168
Céls. Mono.: 12,51±1,034 e 16,70±2,012
Neutrófilos: 5,282±0,7762 e 2,731±0,1410
Eosinófilos: 0,7638±0,09900 e 0,5667±0,1273
N=13
N=9
OVA i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Sangue
Total i.m
Cél. Total: 18,36±1,507 e 19,62±1,715
Céls. Mono.: 13,01±1,556 e 12,13±1,579
Neutrófilos: 4,528±0,6507 e 6,251±0,7904
Eosinófilos: 0,7585±0,1450 e 0,7958±0,1312
N=13
N=12
OVA i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Plasma
i.m
Cél. Total: 18,36±1,507 e 18,44±1,841
Céls. Mono.: 13,01±1,556 e 14,66±1,623
Neutrófilos: 4,528±0,6507 e 3,421±0,3361
Eosinófilos: 0,7585±0,1450 e 0,6322±0,1118
N=13
N=9
OVA i.n + Salina i.m
versus OVA i.n +
Hemácias i.m
Cél. Total: 18,36±1,507 e 20,28±2,168
Céls. Mono.: 13,01±1,556 e 16,70±2,012
Neutrófilos: 4,528±0,6507 e 2,731±0,1410
Eosinófilos: 0,7585±0,1450 e 0,5667±0,1273
N=13
N=9
Tabela 5 – Dados da figura 10 representados como Média±Erro padrão da média (SEM).
39
A) B)
C) D)
FIGURA 10 - Os efeitos da hemoterapia e suas frações no número de células inflamatórias no
sangue. Contagem do número total de células (A), mononucleares (B), neutrófilos (C) e eosinófilos (D) no
sangue de animais desafiados com OVA e tratados com sangue
intramuscular ou suas frações. Dados
representados como Média±Erro padrão da média (SEM) de 2
experimentos independentes, com n= 9-13. *
representa diferença significativa (P< 0,05) entre dois grupos comparados par a par por teste t.
Salina
Salina
Sangue Total
Plasma
Hemácias
0
10
20
30
40
OVA
Salina
Nº células x 10 6 / mL
Salina
Salina
Sangue Total
Plasma
Hemácias
0
10
20
30
OVA
Salina
N° mononucleares x 10 6 / mL
Salina
Salina
Sangue Total
Plasma
Hemácias
0
5
10
15
Salina OVA
*
*
N° neutrófilos x 10 6 / mL
Salina
Salina
Sangue Total
Plasma
Hemácias
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Salina OVA
N° eosinófilos x 10 6 / mL
40
5.5. O tratamento com sangue total e com hemácias tem influência sobre o número total de
leucócitos e de eosinófilos na medula óssea dos animais
asmáticos.
Para avaliar melhor o recrutamento celular e a influência da hemoterapia no neste modelo,
analisamos o número e tipos celulares presentes na medula óssea.
Após 24 horas do ultimo
desafio, coletamos as células de medula do fêmur da ultima injeção para as contagens de células
totais e diferenciais. A fim de analisar se o uso do sangue e suas frações influenciam o número de
leucócitos na medula óssea, contabilizamos o número total de células e observamos que o grupo
de animais asmáticos tratados com hemácias apresentaram uma
quantidade de células na medula
diminuída em relação aos animais não alérgicos e aos animais alérgicos não tratados (Figura 11A).
Realizamos então as contagens diferenciais das lâminas d
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