Espaço para a discussão sobre a AHT (AUTO-HEMOTERAPIA) e envio de relatos sobre experiências dos usuários desta técnica terapêutica. A AUTO-HEMOTERAPIA é uma técnica simples, em que, mediante a retirada de uma pequena quantidade de sangue da veia e sua imediata aplicação no músculo, estimula um aumento dos macrófagos, que são as células sangüíneas que fazem a "limpeza" de tudo o que é prejudicial no organismo, eliminando bactérias, vírus, as células cancerosas, etc. Esse aumento da produção de macrófagos pela medula óssea (de 5% para 22%) se deve ao fato de que o sangue injetado no músculo funciona como um "corpo estranho" a ser rejeitado pelo Sistema Retículo Endotelial (SRE), o que faz com que o nível imunológico se eleve, permanecendo ativado durante 5 dias, após os quais o percentual de macrófagos vai decaindo até o sétimo dia, retornando aos 5%. Com isso, inúmeras doenças, inclusive as graves como as auto-imunes, regridem rapidamente, proporcionando o restabelecimento da saúde. A AHT, entretanto, não representa nenhum risco para o paciente e não produz efeitos colaterais. Este fórum se destina primordialmente àqueles que já utilizam a AHT e não possuem mais dúvidas sobre sua eficácia, mas também admite a discussão séria e responsável sobre o assunto, tendo em vista o envio de orientações sobre os detalhes da técnica, tanto para os que já a utilizam, como para os que desejam passar a utilizá-la e querem se informar melhor sobre a mesma.

Tags: tratamento medicina sangue enfermagem autohemoterapia anvisa crm auto-hemoterapia coren cfm sus
11/12/2010 23:25
De: Walter Medeiros (waltermedeiros@supercabo.com.br)
IP: 187.111.252.232

DR. MOURA ESPERA QUE MAIS COLEGAS PASSEM A USAR A AUTO-HEMOTERAPIA

A esclerodermia e outras enfermidades foram tratadas com ajuda da auto-hemoterapia pelo Dr. Luiz Moura, médico carioca que gravou um DVD em 2004, que desde a sua publicação vem tendo imensa repercussão no Brasil e em vários outros países. No vídeo o Dr. Moura relata que em 1976 era chefa da chefe da clínica médica do Hospital Cardoso Fontes, e tinha uma consultora dermatológica, a Dra. Ryssia Alvarez Florião.  Em certa ocasião internou-se uma senhora que havia oito meses não andava. A Dra. Ryssia fez três biópsias, mandou para a Dra. Glória Moraes - chefe da Anatomia Patológica, que deu o laudo: “esclerodermia fase final”.
Ele lembra que em face da situação a Dra. Ryssia resolveu dar uma aula sobre o assunto, explicando que toda segunda-feira era proferida uma aula sobre os casos que não fossem rotineiros. “E esse era um caso bastante raro; esclerodermia é uma doença auto-imune e que não é freqüente” – esclarece. Segundo Dr. Moura, foi dada uma aula belíssima, na qual ele aprendeu muito, porque não sabia nada sobre a esclerodermia: “sabia de livro, nunca tinha visto paciente esclerodérmico” – continuou. Em seguida disse que quando terminou a aula, a Dra. Ryssia mandou a enfermeira levar a paciente e entendeu que chegara a hora de dizer o que poderia ser feito pela paciente. “Você mandou levar a paciente para ela não escutar” – opinou. A médica confirmou e revelou: “É verdade, eu não tenho nada a fazer pela paciente.”
DESENGANADA
Naquela ocasião Dr. Luiz Moura indagou à colega médica: “Você me entrega essa paciente para eu aplicar uma técnica que não é corrente e chama-se auto-hemoterapia?”. Ela riu e disse: “O senhor sabe que eu cheguei em maio dos EUA, lá eu era residente médica numa clínica para aonde convergiam todos os casos de esclerodermia de todos os EUA. E a clínica não era mais nada do que um depósito de esclerodérmicos. Não havia mais nada a fazer. Então o senhor acha que pode fazer?”.  Ele respondeu: “Olha, eu vou agora em casa pegar os  trabalhos do Dr. Jesse Teixeira e do Dr. Ricardo Veronesi, e você vai ver que a idéia tem fundamento.”. Na volta, leu as partes principais dos dois trabalhos e perguntou: “E agora Ryssia?”. “Ah, tem lógica, pode funcionar, vale a pena." – respondeu-lhe a médica.
A partir dali Dr. Moura aplicou a auto-hemoterapia, mas como era uma coisa nova a ser feita num hospital, usou o que chamou de uma dose brutal: tirou 20 (vinte) cc de sangue da veia e aplicou 5 (cinco) cc em cada braço (deltóide) e 5 (cinco) em cada nádega, porque tinha que produzir um resultado: “ou funcionava ou não funcionava, eu tinha que chegar a uma conclusão” - decidiu. O médico narra que “A melhora foi uma coisa espantosa. A paciente, que estava com a pele como se fosse pele de jacaré, dura, caminhando para uma morte terrível, a asfixia - porque não consegue respirar mais; o pulmão não pode se expandir, porque o corpo fica como um bloco de madeira; e, por incrível que pareça, trinta dias depois, no dia 10 de outubro de 1976, a mulher saiu andando do hospital.  
OUTRAS INDICAÇÕES
Dr, Luiz Moura fala também sobre outras indicações da auto-hemoterapia, assegurando que são muitas e enumera: primeiro, todas as doenças infecciosas, de modo geral; segundo, todas as doenças alérgicas, pois a auto-hemoterapia tem o que ele define como um efeito maravilhoso na asma brônquica, nas alergias cutâneas, em doenças que ainda não se sabe bem o que são, por exemplo na psoríase, na qual funciona maravilhosamente bem. Continuando a enumeração, diz que a técnica é indicada nas doenças auto-imunes, que são muitas hoje, citando Doença de Crohn, uma doença auto-imune que destrói o intestino, os anticorpos e ataca o final do intestino delgado. Revela que usou para Lupus, contando sobre a paciente R.S., uma moça que ensina as crianças a bailar em Caxias (Rio de Janeiro), que sofre de lúpus, porém o mal está assintomático. “É como se tivesse curada. Ela leva as crianças todo ano, patrocinado pela Itália, para dançar lá na Itália; crianças de rua que ela ensina a dançar. Essa moça eu tratei de lúpus, ela não podia, não tinha condições de trabalhar e nem fazer nada”.
Conforme o relato do Dr. Moura, a auto-hemoterapia também dá um excelente resultado em atrite reumatóide. Conta que tem uma paciente da UFRJ, “uma funcionária de lá que estava praticamente sem andar há 8 anos e com a auto-hemoterapia ela está hoje normal. Ela sobe no meu consultório, pega ônibus. Não tem mais problema nenhum”. Nas miastenias graves, refere-se a um paciente que tem a sua idade. Aquela paciente foi diagnosticada como miastenias graves em 1980, no Instituto de Neurologia, na Av. Pasteur, e foi dado como não tendo nada o que fazer, porque nada se fazia mesmo. “E ela vem fazendo a auto-hemoterapia desde 1980. Ela é a única sobrevivente de miastenias graves; de todos os pacientes que tinham miastenias graves na época, não existe nenhuma viva, só ela. E vai ao meu consultório com a filha, de ônibus. Isso 24 anos depois”, completou.
DIVULGAÇÃO
O médico diz que “é realmente uma coisa incrível não se divulgar um trabalho que beneficia e alivia o sofrimento de tanta gente; em tantas direções, em tantas patologias, em tantos tipos diferentes de doenças crônicas, e agudas também”. E continua: “Eu, por exemplo, sei que estou errado em não tomar vacina de idoso, mas como eu faço a auto-hemoterapia acho que não preciso, porque eu tenho meu Sistema Imunológico ativado. Não condeno não, ótimo que todo mundo use a vacina de gripe. Eu não preciso, eu nem minha mulher, pois fazemos a auto-hemoterapia e mantemos nosso Sistema Imunológico ativado”. Avalia que “Então realmente é um recurso terapêutico que tem uma amplitude enorme”.
“Em 1980 atendi uma senhora, funcionária da Petrobrás, cujo serviço médico diagnosticou esclerodermia. Não tendo o que fazer, decidiram então aposentá-la. Foi quando ela me procurou, eu contei o caso de 4 anos antes - o caso de esclerodermia da outra paciente do Hospital Cardoso Fontes. Ela decidiu fazer o tratamento, e não tem sintoma nenhum, até o dia de hoje (2004)”. Informava que a mulher só iria se aposentar no ano de 2005, por tempo de serviço, 25 anos depois de uma indicação de aposentadoria precoce.  
COMPROVAÇÃO
Defende que “Então realmente é uma coisa que poderia mudar a vida de muita gente, como mudou a vida dela. Imagine se ela se aposentasse naquela altura, que aposentadoria ela teria hoje? Que situação ela teria? Bom, provavelmente nem viva ela estaria, se não tivesse feito esse tratamento”, garante. “A auto-hemoterapia é um recurso que tem um número enorme de aplicações, e que tem uma explicação científica de como funciona. Não é algo a dizer que é misterioso, que é uma magia, ou uma panacéia qualquer, não! Sabe-se como funciona” - explica.
Observa também que “Os trabalhos anteriores, europeus, todos eram na base do empirismo, ninguém tinha comprovado como funcionava. Foi um brasileiro, o professor Jesse Teixeira, que comprovou como funcionava, em 1940. Era para esse tratamento ter sido divulgado e estar sendo usado, porque a medicina se torna cada vez mais cara”. Avalia que “As doenças que a auto-hemoterapia evita ocorrem muito na idade avançada, o idoso está se tornando um paciente que representa um peso muito grande nas despesas com saúde; e é por isso que os planos de saúde cobram um absurdo dos idosos, porque realmente eles custam muito caro para ser mantidos com vida e relativa saúde”. Afirma que “é realmente uma coisa muito valiosa esse tratamento. Eu espero que se consiga ir divulgando e com o tempo isto será conseguido, fazendo com que alguns colegas passem a usá-la, pressionados pelos pacientes. A verdade é que quando se vêem os resultados e não têm como explicar, saem pela tangente e dizem ser remissão espontânea. É uma saída, para não admitir que foi a auto-hemoterapia”.
20/07/2015 10:14
De: Helena
IP: 189.14.213.43

COMPROVANDO A EFICÁCIA DA AUTO-HEMOTERAPIA

Sofria a anos de uma alergia terrível, vivia com dificuldade de respirar, tomava medicamentos para depressão,  uma vez que se ficasse sem os quais parecia que ia ficar louca, sentia muita pressão na cabeça e na nuca. Minha mãe sofre de crohn e eu já estava desesperada. Foi quando fazendo uma pesquisa pela internet achei os videos sobre a hemoterapia e comecei a fazer, eu meu filho e minha mãe.  Resultado: hoje me sinto muito bem com 4 aplicações já
parei com os medicamentos depressivos,  alergia estou praticamente curada, meu filho está
ótimo,  minha mãe está cada dia melhor.  Isto é realmente uma bênção divina. Se alguém está
passando por estas e outras acredite podem ir em frente sem medo, pois eu enfrentei o meu e me sinto muito abençoada através da HEMOTERAPIA.
29/07/2011 00:49
De: M.Fetha
IP: 189.63.216.141

MAIS OUTRO CASO DOCUMENTADO QUE COMPROVA A EFICÁCIA DA AUTO-HEMOTERAPIA: testemunho de Italo Oliveira de Carvalho - curado de mal de Crohn

MAIS OUTRO CASO DOCUMENTADO QUE COMPROVA A EFICÁCIA DA AUTO-HEMOTERAPIA:
Video com colonoscopias que comprovam a cura de mal de Crohn com a auto-hemoterapia http://www.youtube.com/watch?gl=BR&v=HZCBagFfMi0
Video mostrando o processo de cura da " Doença de Croan" de acordo com relato pessoal do paciente : Italo Oliveira de Carvalho, 54
canal: http://www.youtube.com/newbevalgueiro
30/08/2015 08:25
De: Evaristo da Veiga
IP: 187.61.209.118

Música


AUTO-HEMOTERAPIA
Como bom cidadão,me sinto na obrigação de contar a minha historia.
está completando dois anos nem um remédio tomando isto é uma grande vitória foi desde adolescente sofri muito minha gente com fortes dor de ouvido e nos últimos dez anos a dor só foi aumentando mas como tenho sofrido.
A noticia se espalhou e o povo já comentou tem câncer o indivíduo por muitos médicos passei muito remédio tomei também fui muito benzido farmacêuticos procurei muito dinheiro gastei só que nada resolvido. em dois meses tava curado eu já ficava animado graças que câncer não é mas só durava um mês voltava tudo outra vez já tinha perdido a fé mas um dia meu irmão deu escondido em minha mão ouça esse DVD Zé.
escutava e escutava isso já me animava Dr. Luiz moura falando da auto-hemoterapia nesta hora eu já saia pros amigos perguntando tu conhece tu já fez e logo eu encontrei amigos me confirmando eu já fiz a cinco anos e o outro fez a seis isto milagre me fez falavam se emocionando resolvi fazer então e já na sexta sessão podem crer de manhã fui me acordando pensei comigo eu duvido levei a mão nos ouvidos será que eu estou sonhando era um alivio profundo vou espalhar pra todo mundo então vou desabafando.
coceira na sola do pé não podia usar calçado.
dor na coluna demais não adiantou ser operado.
duas semanas de cama quando ficava gripado.
a dor no peito era forte quando dormia de lado
do peito do braço a mão de dor eu era acordado.
colesterol sempre alto eu ficava indignado.
hoje completa dois anos de tudo fui libertado
eu como churrasco gordo nem gripe tenho pegado
não entro mais em farmácia os médicos deixo de lado
tudo que aqui está escrito nestes meus versos rimados
é verdade assino em baixo sem medo bem declarado
porque querem proibir se só da bom resultado
eu até fiz uma música no cd do ano passado
abra o vídeo e escute como estou indignado
pois eu nunca fui omisso e a todos muito obrigado. JOSÉ BARTH (ZÉ BARTH)
https://www.youtube.com/watch?v=EbyNoCNGCbs
15/09/2015 18:16
De: José Augusto
IP: 191.179.121.95

Quero voltar a fazer auto-hemoterapia - Olinda

Boa noite.
Me chamo Augusto, e moro em Olinda-Pernambuco. Alguns anos atrás, quando morava com meus pais e irmão em Recife, todos fazíamos sessões semanais de auto-hemoterapia em casa, com uma conhecida de uma amiga nossa. Acontece que perdemos o contato com ela, e me mudei para Olinda há alguns anos.
Sinto muita falta das sessões semanais, e quero muito voltar a fazer. Por favor, me ajudem. Alguém conhece pessoa que possa me ajudar com as sessões aqui em Olinda, ou mesmo Recife?? Obrigado!
20/09/2015 21:10
De: Evaristo da Veiga
IP: 187.61.209.118

Videos

Vídeos sobre auto-hemoterapia
geram muitos milhões de acessos
A falta de políticas públicas e oficiais sérias e verdadeiramente preocupadas com a saúde e o bem-estar da população vem
levando os cidadãos a buscarem na internet alternativas e
soluções para seus problemas. Um desses meios é a auto-
hemoterapia, que vem tendo sua eficácia comprovada
diuturnamente em todo Brasil, inclusive com relatos no Portal Médico, do Conselho Federal de Medicina - CFM, de tratamento e cura de inúmeras doenças através da terapia do sangue.
Para ter uma ideia da busca pela técnica, que consiste da retirada de sangue da veia e imediata aplicação no músculo, basta acessar o Youtube e chamar pela palavra “auto-hemoterapia”(
https://www.youtube.com/results?search_query=auto-hemoterapia ). O retorno, conforme experiência feita neste sábado
(19.09.2015), é impressionante. Entre os inúmeros vídeos
divulgados por entidades, sites, blogs, cidadãos, médicos,
enfermeiros, emissoras de rádio e TV, jornais, revistas, boletins e outros meios, os 100 primeiros pela ordem de visitação mostravam a marca respeitável de mais de 13.570.000 (Treze milhões,
quinhentos e setenta mil) acessos.
Esta realidade demonstra como os poderes públicos responsáveis precisam deixar de fazer vistas grossas e enfrentar o problema de saúde dos brasileiros através de providências no sentido de
pesquisar a técnica e comprovar sua eficácia, bem como cancelar a proibição arbitrária e injusta do seu uso. Com  estas providências os profissionais e serviços de saúde deixarão de viver sob a pressão de uma restrição totalmente enviesada ao uso de uma
terapia com quase duzentos anos e que em todo esse tempo
nunca enfrentou registro de malefício causado a nenhum usuário.
É hora, portanto, do Poder Executivo Federal, do Congresso
Nacional e do Poder Judiciário darem suas respostas ao clamor da sociedade, pois a todos eles o assunto já foi apresentado. Da mesma forma que outros setores importantes, bem como a
sociedade civil - como Ordem dos Advogados do Brasil, Ministério Público, Sindicatos, Associações e os profissionais de todas as categorias precisam marcar presença e tomar iniciativas capazes de mudar esse quadro de penúria ao qual os brasileiros estão submetidos.
17/10/2015 08:42
De: Evaristo da Veiga
IP: 187.61.209.118

Pesquisas

Grande bazófia do Conselho Federal de Medicina
--- Walter Medeiros – waltermedeiros@supercabo.com.br
Em meio a milhares de mensagens postadas no Portal Médico, do Conselho Federal de Medicina – CFM de internautas mostrando que fazem uso da auto-hemoterapia e que a técnica é eficaz no combate e cura de doenças, além de aumentar a imunidade dos
usuários, uma nos chamou atenção. A de Rosa Batista, publicada no dia 12.10, às 09:34 h, que afirma: “Se o conselho insiste em não reconhecer a eficiência, que divulgue em que está baseado.  Pois contra fato não há argumento...!!!”.
Ao ler a mensagem resolvemos retornar ao texto do CFM que tem o título “CFM reforça que auto-hemoterapia não tem eficácia comprovada”, publicado no dia 27 de Fevereiro de 2015, às 12:47
h. Conforme observa a internauta, a matéria diz que “O
procedimento da auto-hemoterapia não tem efetividade científica comprovada e pode trazer danos”. A afirmação de que não teria efetividade comprovada já está mais do que desmentida, pois todo dia surgem depoimentos e mais depoimentos mostrando que a
técnica funciona. E quanto à afirmação de que “pode trazer danos”, caberia ao CFM indicar que danos, pois faz quase duzentos anos que a auto-hemoterapia é usada e nunca foi mostrado nenhum
dano causado pelo seu uso.
Mais patético ainda é o texto dizer que “O alerta é do Conselho Federal de Medicina (CFM) que reforça a proibição da sua prática por médicos, pois tem recebido questionamentos e denúncias de pessoas leigas utilizando e divulgando a técnica.”. Aí está um grande mal que o CFM faz aos brasileiros, proibir e ainda por cima reforçar a proibição da prática pelos médicos. Uma agressão à arte de curar, conforme já foi dito pelo eminente médico Francisco Rodrigues. Quanto aos questionamentos e denúncias que diz ter recebido de que pessoas leigas utilizam e divulgam a técnica, por tratar-se de órgão de interesse público, deveria publicar as referidas denúncias e os questionamentos, numa atitude de
transparência que é indispensável em questão de tamanha
responsabilidade. Mais uma vez, na sua curta mensagem a
internauta mostrou como o CFM trata de forma estranha os
interesses dos cidadãos brasileiros.
A matéria do Portal Médico explica que “A auto-hemoterapia consiste em retirar sangue de uma veia e aplicar no músculo da própria pessoa como forma de tratar algumas doenças.” E repete que “Em 2007, o CFM emitiu o Parecer nº 12, ainda vigente, informando que “não existem estudos relativos à auto-hemoterapia desde a sua proposição como recurso terapêutico” e que “não há
evidência científica disponível que permita a sua utilização em seres humanos”. Aqui as afirmações estão longe da verdade e mostra desconhecimento ou má fé do próprio Portal Médico.
Primeiro, porque o próprio Parecer nº 12 cita trabalhos que tratam do assunto e trazem comprovações. Segundo, porque o próprio
CFM foi obrigado, por reclamações dos próprios médicos
anestesistas, a permitir a auto-hemoterapia na forma de Tampão Sanguíneo Peridural –TSP e declarou no seu próprio jornal que a técnica tem ampla comprovação científica. Além do que nada
reclama do uso da auto-hemoterapia em forma de Plasma Rico em Plaquetas - PRP, que recupera atletas com rapidez e é usada na medicina esportiva. Some-se a isso o uso em estética e os
incontáveis depoimentos de usuários no facebook do próprio CFM.
Diz ainda a matéria que “A opinião é compartilhada pela Associação Brasileira de Hematologia e Hemoterapia (ABHH) que em seu site divulga que a “auto-hemoterapia é adotada por leigos e é desaconselhada por, além de não ter nenhum benefício
comprovado no campo da ciência, poder apresentar inúmeros
riscos à saúde”. Mais uma formulação que chega a ser irrisória, pois já está bem claro que a ABHH nunca apresentou nada além dessas afirmações vulgares que deviam envergonhar os médicos, cientistas e pesquisadores brasileiros.
Por fim, a matéria diz que “Pelo perigo e inconsistência científica, a auto-hemoterapia não pode ser usada pelos médicos”. Voltamos a perguntar: que perigo? Que inconsistência científica? A
inconsistência é do próprio CFM, que devia estar preocupado com a pesquisa da auto-hemoterapia, a fim de garantir a saúde da população. Concluindo, a matéria do Portal Médico diz que “Os médicos que a praticarem poderão sofrer penalidades que podem chegar ao registro profissional cassado”, informando tratar-se de afirmação do corregedor do CFM, José Fernando Maia Vinagre.
Essa postagem do Portal Médico findou transformando-se no que pode ser caracterizada como uma verdadeira bazófia. Basta dar uma olhada na postagem e avaliar quem está completamente fora da realidade: o CFM ou os usuários da auto-hemoterapia, que
estão resolvendo seus problemas de saúde e aumentando a sua
imunidade com o uso daquela técnica. O link é este que
mostramos a seguir:
https://www.facebook.com/conselhofederaldemedicina/photos/a.14
19721984936536.1073741828.1419429351632466/157482832609
2567/?type=1&theater
Aliás, passados quase oito anos da publicação do famigerado
Parecer nº 12, já é hora do Conselho Federal de Medicina – CFM, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária – Anvisa e demais órgãos interessados, inclusive Ordem dos Advogados do Brasil,
Ministério Público Federal trazer esse assunto para discussão e finalmente ouvir os verdadeiros interessados: a população
brasileira.
21/10/2015 00:59
De: Fetha
IP: 191.29.12.78

AUTO-HEMOTERAPIA CURA PENFIGO FOLIACEO (FOGO SELVAGEM)

AUTO-HEMOTERAPIA CURA PENFIGO FOLIACEO (FOGO
SELVAGEM):

Lívia Santanna Publicou no Grupo Auto-hemoterapia. Meu sangue me Cura.

Quero deixar hj meu testemunho para ajudar alguém que esteja hj com o mesmo problema q tive. Em março de 2013 apareceu na
minha maçã do rosto do lado direito como se fosse uma espinha.
Ela estourou e foi aumentando de circunferência e ficou em carne viva. Passei por momentos difíceis pois era visível e todos
perguntavam o q era. Me sentia mal e até humilhada. Procurei os melhores dermatologistas do R.J. e após duas biopsias descobri penfigo foliaceo ou vulgarmente chamado como fogo selvagem.
Nenhum remédio ou pomada resolveu. Até q comecei por conta pp a estudar aht. Comecei fazendo 4 meses 10 ml e não fez muito efeito até q por uma outra orientação me mandaram fazer 20 ml em um mês e 10 em outro e assim sucessivamente. Em 3 meses
td sumiu. Estava começando tb a se espalhar pelo meu corpo
porém menores q no rosto. Não podia pegar sol. Hj estou mega feliz. Agora faço 10 ml toda semana para manter. Pego sol e
quase não tem mancha. Colocarei fotos. Espero ajudar alguém
que tenha um problema parecido com o meu apesar de raro. Obs:
duas fotos antes e depois.
-
* Comentário do produtor do DVD da Auto-hemoterapia:  

Luiz Fernando Sarmento
10 min · Editado ·  

Recebi de Marcelo, compartilho com grande prazer.
Anima a gente, traz alegria.
No primeiro comentário abaixo,
compartilho também, pra quem deseje saber mais,
o vídeo Auto-Hemoterapia - Conversa com Dr. Luiz Moura.

HTML
http://www.geocities.ws/autohemoterapiabr/AHT_cura_penfigo_foli aceo.htm
09/11/2015 14:34
De: Olivares rocha
IP: 189.126.205.12

Estudos sobre a Ah há. O que não há é interesse mercadológico. Somada à fosfoamina seria a cura

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
Joyce Nunes Vieira
ESTUDO DA HEMOTERAPIA NO MODELO DE ASMA
ALÉRGICA INDUZIDA POR OVALBUMINA (OVA) EM
CAMUNDONGOS
RIO DE JANEIRO
2015
Joyce Nunes Vieira
ESTUDO DA HEMOTERAPIA NO MODELO DE ASMA
ALÉRGICA INDUZIDA POR OVALBUMINA (OVA) EM
CAMUNDONGOS
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós Graduação em Ciências
(Microbiologia) no Instituto de Microbiologia
Paulo Goés na Universidade Federal do Rio
de Janeiro, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Mestre em
Ciências (Microbiologia).
Orientador: Marcelo T. Bozza
RIO DE JANEIRO
2015
I
S000 Vieira, Joyce Nunes
ESTUDO DA HEMOTERAPIA NO MODELO DE ASMA ALÉRGICA
INDUZIDA POR OVA
(OVA) EM CAMUNDONGOS/ Joyce Nunes Vieira. Setembro/2015.
64p. f.: il.
Dissertação (Mestrado em Microbiologia) –
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto
de Microbiologia Paulo de Góes IMPG, Rio de Janeiro, 2015.
Orientador: Marcelo Torres Bozza
1. Imunidade e Inflamação. 2. Asma 3. OVA e Hemoterapia. 4.
Dissertação Microbiologia
– Teses
I. Bozza, Marcelo Torres (Orient.).II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas – Microbiologia. Instituto de Microbiologia Paulo de Góes –
IMPG. III. ESTUDO DA HEMOTERAPIA NO MODELO DE ASMA
ALÉRGICA INDUZIDA
POR OVA (OVA) EM CAMUNDONGOS
CDD:
II
Joyce Nunes Vieira
Estudo da hemoterapia no modelo de asma
alérgica induzida por ovalbumina (OVA) em
camundongos
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas (Microbiologia), Universidade Federal
do Rio de Janeiro, como requisitos parcial à
obtenção do título de Mestre em Ciências
Biológicas (Microbiologia).
Aprovada em / /
_____________________________________________________
_____
(Marcelo Torres Bozza, Professor do Departamento de Imunologia
– IMPG/UFRJ)
_____________________________________________________
_______
(Alberto Félix da Nóbrega – Professor do Departamento de
Imunologia – IMPG/UFRJ)
_____________________________________________________
_______
(Flavio Alves Lara – Pesquisador do Instituto Oswaldo Cruz -
FIOCRUZ)
_____________________________________________________
_______
(Priscilla Christina Olsen, Professora da Faculdade de Farmácia –
UFRJ)
_____________________________________________________
__________
(Leonardo Nimrichter, Professor do Departamento de Imunologia –
IMPG/UFRJ)
_____________________________________________________
__________
(Juliana Echevarria Lima, Professora do Departamento de
Imunologia – IMPG/UFRJ)
Joyce Nunes Vieira
III
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus primeiramente. Agradeço aos meus pais Sara e Neivaldo por me ensinarem
tudo, a ter foco, dedicação e paixão, por me ensinarem o valor do estudo, e por me lembrarem
sempre que o mundo pode me tirar tudo, menos o conhecimento.
Agradeço ao meu noivo Aloisio, pela sua paciência e atenção.
Obrigada por perder seu tempo
lendo e debatendo comigo sobre meus trabalhos, e por me
incentivar sempre a ser melhor, não só
na vida profissional, mas também pessoal.
Obrigada ao meu orientador Marcelo Bozza por ter aceitado uma aluna de mestrado vinda lá de
longe, sem muita bagagem ou referências. Muito obrigada sempre por acreditar em mim. Obrigada
Heitor De Paula, o melhor co-orientador que eu poderia ter!
Obrigada pelas suas idéias,
ensinamentos, e por acreditar em mim mais do que eu mesma
muitas vezes.
A todos do laboratório de Inflamação e Imunidade, Andreza,
Caroline, Daniel, Danielle, Elisa,
Ellen, Fabianno, Fabrício, Hilton, Isabelle, Jennifer, Lara, Letícia Alves, Letícia Lintomen,
Luciana, Luiz, Marianna, Rafael, Sheila e Thamara. Agradeço a vocês por me ensinarem
tanto, por fazerem meus dias mais alegres, por se tornarem mais que colegas de trabalho, por
serem meus amigos. Já estou repleta de saudades e saibam que estarei com todos sempre no
coração e nas memórias hilárias.
As professoras Priscilla Olsen e Juliana Eshevarria pelos
conselhos, dicas e ajuda com toda a
boa vontade em todas as vezes que precisei.
Agradeço também aos técnicos Allyson e Nazioberto do Hospital Universitário pela ajuda e
ensinamento nas colorações e a técnica Daiana da FIOCRUZ por realizar os testes de hiperreatividade,
e ao Jamil pela ajuda nas quantificações de muco e colágeno.
E agradeço a banca, os professores Flávio Lara, Priscilla Olsen, Alberto Nóbrega, Leonardo
Nimrichter e Juliana Eshevarria, e a minha revisora Luciana Arruda.
IV
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Esquema mostrando o procedimento da
hemoterapia................................................13
Figura 2. Mapa epidemiológico da distribuição dos indivíduos asmáticos....................................16
Figura 3. Esquema modificado da resposta imune inata na asma alérgica ....................................19
Figura 4. Esquema modificado da resposta Th2 na asma
alérgica..................................................21
Figura 5. Desenho experimental do
tratamento..............................................................................24
Figura 6. Contagens total e diferencial de células no
BAL............................................................32
Figura 7. Contagens total e diferencial de células no
sangue.........................................................34
Figura 8. Contagens total e diferencial de células no
BAL............................................................37
Figura 9. Contagens total e diferencial de células no
sangue.........................................................39
Figura 10. Contagens total e diferencial de células na medula óssea.............................................41
Figura 11. Quantificação de IL-4 no BAL e homogenato
pulmonar..............................................44
Figura 12. Quantificação de IL-5 no BAL e homogenato
pulmonar.............................................46
Figura 13. Quantificação de IL-13 no BAL e homogenato
pulmonar...........................................48
Figura 14. Quantificação de
colágeno............................................................................................
.50
Figura 15. Quantificação de
muco..................................................................................................
52
V
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Concentrações de anticorpos dos kits de ELISA
Peprotech............................................28
Tabela 2. Dados representados em Média±Erro padrão da média
(SEM) do número de leucócitos
no BAL
...........................................................................................................
.................................31
Tabela 3. Dados representados em Média±Erro padrão da média
(SEM) do número de leucócitos
no
sangue...............................................................................................
..........................................33
Tabela 4. Dados representados em Média±Erro padrão da média
(SEM) do número de leucócitos
no BAL
...........................................................................................................
................................36
Tabela 5. Dados representados em Média±Erro padrão da média
(SEM) do número de leucócitos
no
sangue...............................................................................................
...........................................38
Tabela 6. Dados representados em Média±Erro padrão da média
(SEM) do número de leucócitos
na medula
óssea.................................................................................................
...............................42
Tabela 7. Dados representados em Média±Erro padrão da média
(SEM) da quantificação de IL-4
por
ELISA.................................................................................................
...................................43
Tabela 8. Dados representados em Média±Erro padrão da média
(SEM) da quantificação de IL-5
por
ELISA.................................................................................................
.....................................45
Tabela 9. Dados representados em Média±Erro padrão da média
(SEM) da quantificação de IL-13
por
ELISA.................................................................................................
....................................47
Tabela 10. Dados representados em Média±Erro padrão da média (SEM) da quantificação
colágeno............................................................................................
..............................................49
Tabela 11. Dados representados em Média±Erro padrão da média (SEM) da quantificação
muco..................................................................................................
..........................................51
VI
LISTA DE ABREVIATURAS
Α Alfa
Β Beta
Γ Gama
μ Micro
AHR Airway hiperresponsiveness / Hiperreatividade
brônquica
AHT Auto-hemoterapia
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
APC Antigen presentin cells / Células apresentadoras de
antígenos /
BAL Bronchoalveolar lavage / Lavado broncoalveolar
BR Bilirrubina
BV Biliverdina
BUXCO Pletismografia de corpo inteiro
CCL Chemokine (c-c motif) ligand / Ligante de
quimiocina
CCR c-c chemokine receptor / Receptor da quimiocina 3
/
CD4 Cluster of differentation / Grupamento de
diferenciação 4
CO Monóxido de carbono
DC Dendritic cells / Células dendríticas
DMSO Dimetilsufóxido ou sufóxido de dimetilo
ELISA Ensaio imunoenzimático
Fe Ferro
FcδR Receptor Fc delta
GM-CSF Granulocyte macrophage colony-stimulating
factor / Fator estimulador de colônia de
granulocito e macrófago
H2O2 Peróxido de Hidrogênio
HDM House dust mite / Ácaro da poeira doméstica
HE Hematoxilia-Eosina
HLA-DR Human leukocyte antigen / Receptor de antigeno
leucocitário humano
HO Heme-oxigenase
IFN Interferon
IgE Imunoglobulina E
IL-4, IL-5, IL-13, IL-25, IL-33… Interleucinas
i.m Intramuscular
i.n Intranasal
i.p Intraperitoneal
LTB4 Leucotrieno B4
MBP Major basic protein / Proteína básica maior
Mg Miligrama
VII
mL Mililitro
MHC Major Histocompatibiliti complex / Complexo de
histocompatibilidade
N Número
NADPH Dicotinamide adenine dinucleotide phosphate
NEA Asma não-eosinofílica
NFĸB Nuclear factor kappa B / Fator nuclear kappa B
Ng Nanograma
NKT Natural killer T
Nrf2 Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2
O3 Ozônio
OVA Ovalbumina
PAS Periodic Acid Shiff / Ácido periódico de Schiff
PBS Phosphate buffer saline / Tampão fosfato salino
PCB Proteína catiônica básica
PCR Reação em cadeia da polimerase
PE Peroxidase eosinofílica
Penh Enhanced pause / Pausa aumentada
Pg Picograma
PRR Pattern recognition receptor / Receptor de
reconhecimento padrão
PGE2 Prostaglandina E2
RANTES Regulated on activation, normal T cell expressed
and secreted
RNS Reactive nitrogen species / Espécies reativas de
Nitrogênio
ROS Reactive oxygen species / Espécies reativas de
oxigênio
Rpm Rotações por minute
SEM Média±erro padrão da média
SnPP Estanho protoporfirina
Th T helper
TGF Transforming growth fator
TMB 3,3´5,5´tetrametilbenzidina
TNF Tumoral necrose fator / Fator de necrose tumoral
TSLP Thymic stromal lymphopoietin / Linfopoietina
estromal tímica
UV Ultra-violeta
WHO World Health Organization / Organização Mundial
de Saúde
VIII
RESUMO
VIEIRA, Joyce Nunes. O ESTUDO DA HEMOTERAPIA NO
MODELO DE ASMA ALÉRGICA
INDUZIDA POR OVALBUMINA (OVA) EM CAMUNDONGOS.
Dissertação (Mestrado em
Ciências Biológicas - Microbiologia) Instituto de Microbiologia Paulo de Góes - IMPG, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2015.
A hemoterapia é um tratamento terapêutico antigo, de baixo custo e que consiste na retirada de
sangue do paciente e a reaplicação intramuscular. Esse tratamento já foi utilizado em uma grande
variedade de doenças e condições com diversos relatos positivos, no entanto, estudos de eficácia
terapêutica ainda não foram realizados. Escolhemos para o estudo da hemoterapia e seus efeitos o
modelo da asma alérgica induzida por ovalbumina (OVA) em
camundongos. A asma é uma doença
respiratória que afeta cerca de 300 milhões de pessoas em todo o mundo, e seus principais sintomas
são tosse, sibilos e falta de ar. É uma doença caracterizada por obstrução e inflamação das vias aéreas,
e hiper-reatividade brônquica a vários estímulos. De cunho
inflamatório, é dirigida por uma resposta
Th2 com a atuação de diversos tipos celulares da imunidade inata e adaptativa, sendo os eosinófilos as
células mais importantes na patogênese da asma. O objetivo desse projeto é, portanto, analisar o efeito
terapêutico do uso do sangue no modelo de asma induzida por
OVA em camundongos. Camundongos
Balb/C foram sensibilizados duas vezes com injeções
intraperitoneais (i.p) de OVA com Hidróxio de
alumínio (Al(OH)3) ou salina, e depois desafiados por 6 vezes com OVA intranasal (i.n), entre os
desafios injetamos por 4 vezes pela via intramuscular (i.m) salina, sangue ou suas frações (plasma e
hemácias). Após o tratamento avaliamos diversos parâmetros
inflamatórios da asma incluindo o
recrutamento leucocitário para os pulmões, o número de leucócitos no sangue e na medula, a
concentração de citocinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) nos extratos pulmonares, a hiper-reatividade
brônquica, a deposição de colágeno, a hiperplasia das células caliciformes e a produção de muco.
Nossos resultados indicam que o tratamento com sangue autólogo influenciou o recrutamento de
eosinófilos para os pulmões e a hiper-reatividade brônquica.
Observamos ainda que tanto o sangue
autólogo total quanto as hemácias diminuíram o recrutamento de eosinófilos para os pulmões, a
concentração de citocinas Th2, a produção de muco e a deposição de colágeno nos pulmões dos
animais desafiados com OVA. Portanto podemos concluir que o
uso do sangue autólogo e da sua
fração de hemácias influencia os principais parâmetros
inflamatórios da asma, sendo necessário agora
elucidar os possíveis mecanismos anti-inflamatórios decorrentes da hemoterapia.
IX
ABSTRACT
VIEIRA, Joyce Nunes. Study of hemotherapy in allergic asthma model induced by ovalbumin
(OVA) in mice. Rio de Janeiro, 2015. Dissertação (Mestrado em
Ciências Biológicas - Microbiologia)
Instituto de Microbiologia Paulo de Góes - IMPG, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de
Janeiro, 2015.
Hemotherapy is an ancient treatment, with low cost that consists in removing blood from a
patient and its intramuscular re-application. This treatment had been used on a wide variety of diseases
and conditions with several reports of improvements. However, therapeutic efficacy studies have not
been performed. We choose the allergic asthma model induced by ovalbumin (OVA) in mice to study
the effects of hemotherapy. Asthma is a respiratory disease that affects 300 million people all over the
world and its main signs and symptoms are coughing, wheezing and shortness of breath. It is
characterized by airway inflammation and obstruction, bronchial hyperreactivity to various stimuli.
Asthma is an inflammatory disease, led by a Th2 response with the involvement of various cells types
of innate and adaptative response, and eosinophils are considered the most important cells in asthma
pathogenesis. The aim of this study was to analyze the putative therapeutic effect of blood injected
intramuscularly in a asthma model induced by ovalbumina (OVA) in mice. Balb/C mice were
sensitized twice with intraperitoneal injections of OVA using aluminum hidroxio (Al(OH)3) or saline
and challenged 6 times intranasally with OVA. Between the
challenges mice were injected 4 times
intramuscularly with saline, blood or its fractions (plasma and erythrocytes). After treatment we
evaluated the following inflammatory parameters, lymphocyte
recruitment, concentration of Th2
citokynes (IL-4, IL-5, IL-13), bronchial hyperreactivity, collagen deposition, hyperplasia of Goblet
cells and mucus production. Ours results indicated that autologus blood influenced the eosinophil
recruitment to the lungs and the bronchial hyperreactivity. Analyzing the influence of blood fractions,
we observed that total blood and erythrocytes decreased eosinophil recruitment, Th2 citokynes , mucus
production and collagen deposition in OVA challenged mice. Thus we can conclude that treatment
with autologus blood and erythrocytes influence inflammatory parameters of asthma, and is necessary
to elucidate the possible anti-inflammatory mechanisms resulting from hemotherapy.
12
1. INTRODUÇÃO
1.1.A hemoterapia
1.1.2. Definição
De acordo com Houaiss e Vilar (2001) a hemoterapia é um
procedimento terapêutico
antigo que consiste na retirada de uma determinada quantidade de sangue de um indivíduo, e sua
imediata reinjeção. Também é conhecida como terapia do soro, imunoterapia ou hemotransfusão
(Mettenleiter, 1936). Foram descritos quatro tipos distintos de
hemoterapia: Tampão sanguíneo
peridural, hemoterapia ocular ou subconjuntival, hemoterapia com adição de agentes e
hemoterapia propriamente dita ou clássica (Pedrosa et al., 1996;
Lenkiewicz et al., 1992; Rosales
et al., 2005; Geovanni e Noberto , 2009). O Tampão sanguíneo peridural consiste na injeção de
sangue autólogo no espaço peridural para tratar cefaléia refratária após anestesia raquidiana e é
descrito como sendo capaz de evitar o vazamento do líquido
cefalorraquidiano (Amorim e
Valença, 2008). A hemoterapia ocular ou subconjuntival consiste na retirada do sangue fresco e
sua reaplicação no globo ocular, junto com vasodilatadores.
Lenkiewicz e colaboradores (1992)
mostraram em um trabalho com pacientes com queimadura
oculares que a hemoterapia foi o
melhor tratamento para a cicatrização dessas lesões. A
Hemoterapia com adição de agentes utiliza
o sangue basicamente como um veículo. Os agentes adicionados ao sangue podem ser fármacos ou
ozônio (O₃), sendo o ultimo já utilizado no tratamento de diversas doenças como asma, doença
arterial, infecções bacterianas e virais. Na ozonioterapia, o ozônio é
misturado ao sangue e pode
ser administrada de duas maneiras, intravenosa, chamada AHT
Major, ou por infiltração ou
intramuscular, denominada AHT Minor (Gracer e Bocci, 2005;
Rosales et al., 2005; Elvis e Ekta,
2011). A Hemoterapia propriamente dita ou clássica consiste na retirada do sangue venoso do
paciente na sua imediata injeção (Figura 1). Há diferentes métodos de aplicação da hemoterapia,
intramuscular com sangue desfibrinado, intramuscular com sangue fresco ou estocado no gelo, e
de maneira intradérmica de sangue fresco. A quantidade de
sangue aplicado varia de 5mL a 10mL
e a quantidade de injeções depende da gravidade da doença. Tais aplicações podem ser feitas nos
músculos ventroglúteos, glúteos máximo e mínimo, alternando as regiões de aplicação. Esses
procedimentos podem oferecer riscos referentes às punções
intravenosas e injeções
intramusculares, como lesões nos vasos e nervos, hematomas,
necrose tecidual e flebites
(Mettenleitter, 1936; Geovanini e Norberto, 2009).
13
Figura 1 – Esquema mostrando o procedimento da hemoterapia propriamente dita. O sangue é retirado da
prega do cotovelo do indivíduo e injetado em seguida de maneira intramuscular. Imagem retirada de
https://mariliaescobar.wordpress.com/2012/11/16/auto-
hemoterapia-em-animais/.
1.1.3. História
O médico francês Francois Ravaut, em 1911, foi o responsável pelo primeiro registro
científico deste tratamento, utilizado inicialmente em enfermidades como febre tifóide, alguns
tipos de dermatoses e asma, e estados anafiláticos. Essa terapia foi amplamente utilizada,
principalmente na Europa, até década de 50, entrando em
decadência com a descoberta e
administração da penicilina (Mettenlleiter, 1936; Teixeira, 1940).
Mettenleitter (1940) demonstrou, ao provocar uma bolha na coxa de seus pacientes com
cantártida, uma substância irritante, que a aplicação de sangue autólogo aumentava a proporção de
macrófagos no local dos 5% encontrados normalmente antes das injeções, para 22%, indicando
que o tratamento ativaria o sistema fagocítico mononuclear. Silva (2009) também observou, em
experimentos com modelo de lesões cutâneas em ratos Wistar,
que as injeções com sangue
aumentam significantemente a leucometria e otimizam o processo de cicatrização, mostrando uma
14
área de cicatrização mais plana, de bordas regulares e cicatriz
quase imperceptível. Estudos
posteriores com o objetivo de avaliar as concentrações de citocinas e o recrutamento leucocitário
mostraram que ratos Wistar tratados com o próprio sangue
apresentam concentrações aumentadas
de Interleucina 12 (IL-12), Interferon Gama (IFN-γ) e o Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α),
indicando o potencial imunomodulatório da hemoterapia (Cáo et al., 2007; Liang e Jiang, 2012).
A hemoterapia, mesmo não sendo um tratamento clínico aprovado para uso em humanos, é
amplamente utilizada pela clínica veterinária, sozinha ou associada a outras medicações. No
tratamento de tumor venéreo, transmissível em cães, o uso do sangue autólogo resultou no
aumento dos parâmetros hematológicos (linfócitos, monócitos, hemácias, hematócritos, plaquetas
e segmentados) e na diminuição dos tumores e da secreção
sanguinolenta. O uso do sangue em
equinos, depois da retirada dos testículos, diminuiu a freqüência de animais apresentando
complicações infecciosas e melhorou a cicatrização desses animais (Souza, 2009; Escodro, 2012;
Spada, 2013).
1.1.4. A hemoterapia em condições alérgicas e pulmonares
O maior estudo realizado acerca do uso da autohemoterapia foi publicado pelo Dr. Jessé Teixeira,
na Revista Brasil cirúrgico, em 1940. O estudo relata os efeitos do uso do sangue autólogo no
tratamento de complicações pulmonares pós-cirúrgicas em 150
pacientes do Hospital Santa Casa
de Misericórdia do Rio de Janeiro. Os pacientes receberam duas injeções de 10 mL de sangue
intramuscular, a primeira logo após a cirurgia e a segunda 5 dias depois. Ao final do tratamento
nenhum paciente apresentou qualquer complicação infecciosa
(Teixeira, 1940). Maddox e Back
(1936) estudaram o efeito da hemoterapia em 24 pacientes
asmáticos e observaram que 75% dos
indivíduos apresentaram diminuição dos sintomas e do número de crises, especialmente pacientes
abaixo dos 10 anos de idade. Um estudo mais recente usando a hemoterapia combinada ao ozônio
(ozônioterapia) realizado em 113 pacientes asmáticos mostrou,
após três injeções, que a terapia
diminuiu os níveis de IgE séricos, da expressão de HLA-DR por células mononucleares do sangue
periférico e de marcadores antioxidantes da via da glutationa nas hemácias desses pacientes,
indicando um efeito imunomodulatório deste tratamento na asma (Rosales et al, 2005).
15
1.1.5. A polêmica do uso da hemoterapia
Embora o uso da hemoterapia tenha um histórico de relatos que sugerem efeitos favoráveis
evitando complicações pulmonares pós-cirúrgicas, melhorando o processo de cicatrização e
reduzindo os sinais e sintomas de uma série de doenças
inflamatórias (dermatites, asma juvenil,
herpes zoster, rinite alérgica, artrite reumatóide, diabetes mellitus tipo 2, psoríase), a sua eficácia e
os mecanismos de ação são vastamente desconhecidos (Maddox
e Back, 1936; Olwin; Ratajczak;
House, 1997; Ramirez, 2000; Rosales et al., 2005). A legislação brasileira diz que apenas médicos
hematologistas ou especialistas em hemoterapia podem realizar a técnica. Entretanto, em função
da falta de trabalhos científicos comprovando a eficácia do uso do sangue autólogo, o Conselho
Federal de Medicina não reconhece este procedimento como
tratamento médico e a Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) considera a hemoterapia um risco à saúde. Os
defensores da hemoterapia, mesmo reconhecendo a falta de
respaldo científico, afirmam que o
tratamento seria eficaz, sendo utilizado por muitos pacientes, em patologias diversas incluindo
doenças inflamatórias, câncer e dores crônicas. Isso aponta para a necessidade de estudos
sistemáticos, com o uso de modelos inflamatórios adequadamente controlados para avaliação dos
seus efeitos e para a elucidação dos mecanismos envolvidos.
1.2. A asma
1.2.1. Epidemiologia
De acordo com a World Health Organization (WHO), a asma é uma doença respiratória
que afeta cerca de 334 milhões de pessoas em todo o mundo,
principalmente nos países em
desenvolvimento como o Brasil (Figura 2). Seus principais sinais e sintomas são tosse, sibilos e
falta de ar, porém em muitos casos os sintomas são inexistentes até a fase crônica da doença. A
fisiopatologia da asma é complexa, e indivíduos diferentes
apresentam quadros clínicos distintos.
Os motivos para tais disparidades ainda não estão completamente esclarecidos, mas parecem
estar ligados a pré-disposição genética, alimentação, estilo de vida e doenças pré-existentes
(Wenzel, 2012).
16
Figura 2 – Mapa epidemiológico da distribuição dos indivíduos asmáticos ao redor do globo. As maiores
concentrações de indivíduos asmáticos estão nas Américas do Sul e do Norte e Oceania (WHO, 2004).
1.2.2. Subtipos de asma
A Asma é influenciada por fatores genéticos e ambientais, e
apresenta fenótipos
relacionados a fatores como a idade do início da doença, respostas a tratamentos e tipo de resposta
inflamatória desenvolvida. Os fenótipos conhecidos são de cunho alérgico precoce e tardio
(atópico), neutrofílico (não-atópico), relacionado à obesidade e
induzido por exercício (Murdoch,
2010; Wenzel, 2012, Zhang et al., 2013). A maior parte dos
pacientes apresenta a asma alérgica
precoce, com os primeiros sintomas ainda na infância e
normalmente associada a outras doenças
de cunho alérgico como a rinite e dermatite atópica (Wenzel, 2012). A asma atópica tardia
usualmente se desenvolve após os 20 anos de idade, é o tipo mais severo de asma, com crises mais
fortes e mais freqüentes, e os indivíduos normalmente apresentam resistência ao tratamento com
corticosteróides (Wenzel, 2012). A asma induzida por exercícios e relacionada à obesidade atinge
adultos, e se apresenta de forma moderada. O tratamento também é feito com corticosteróides,
broncodilatadores, ou modificadores de leucotrienos (Wenzel, 2012). A asma não-eosinofilica
(NEA) ou não-atópica é caracterizada pelo influxo de neutrófilos,
mastócitos e macrófagos para os
pulmões. (Zhang et al., 2013). Os casos mais severos de asma são encontrados em pacientes
adultos com asma atópica que apresentam além da eosinofilia, a neutrofilia. Em sua fisiopatologia
17
há a participação de diversas células e mediadores inflamatórios do sistema imune inato e
adaptativo (Williams et al., 2012).
1.2.3. A asma alérgica
A asma alérgica é uma doença crônica, caracterizada por altos níveis de IgE, influxo
leucocitário, hiper-reatividade e obstrução reversível das vias aéreas, e pelo aumento da produção
de muco pelas células caliciformes (Bousquet et al, 2000; Nials e Uddin, 2008). De cunho
inflamatório, é dirigida por uma resposta Th2 com a participação de células do sistema inume
inato e adaptativo, como macrófagos aleveolares, células
dendríticas, mastócitos, basófilos,
neutrófilos, NKT (natural killer T), linfócitos inatos, linfócitos T
CD4+. No entanto, os
eosinófilos são células chave na patogênese da asma (Nakagome e Nagata, 2011, Halim et al.,
2012). Diversos mediadores inflamatórios e citocinas tem papel importante em promover
infiltrado celular e inflamação nas vias aéreas, e remodelamento tecidual, especialmente as
citocinas IL-4, IL-5 e IL-13 (Lai et al, 2008; Williams et al, 2012).
1.2.4. A resposta Th2 na asma alérgica
O processo inflamatório na asma é iniciado a partir do contato com alérgenos como ácaros
de poeira doméstica, pólen, produtos químicos, fumaça, entre outros, porém apenas alguns
indivíduos sensibilizados desenvolvem a doença. As causas para essa pré-disposição ainda são
desconhecidas, embora algumas hipóteses tenham sido propostas na tentativa de explicar tal
heterogeneidade, como a influencia de infecções virais e
bacterianas sobre o epitélio pulmonar e
polimorfismos em genes-alvo. Contudo mais estudos são
necessários para se determinar a
contribuição relativa de cada um desses componentes (Holgate et al, 2010; Locksley, 2010).
Existem 3 estágios da resposta Th2 na asma alérgica, a fase de sensibilização, fase aguda e
fase crônica da doença. Na fase de sensibilização o indivíduo tem o primeiro contato com o
alérgeno, secretando anticorpos específicos. A fase aguda se iniciará após o segundo contato com
o alérgeno e a fase crônica é resultado do contato contínuo, e é
caracterizada pelo remodelamento
das vias aéreas (Magalhães et al., 2007; Nials et al., 2008;
Locksley, 2010).
18
1.2.4.1.A fase de sensibilização
O epitélio pulmonar é uma importante barreira física, com grande capacidade de
regeneração tecidual, porém já foi visto em adultos asmáticos que essa regeneração é prejudicada.
Infecções, poluentes e o contato com outros alérgenos como o ácaro de poeira doméstica podem
causar lesões no epitélio, iniciando um sinal de dano, ativando receptores da imunidade inata das
células epiteliais, os receptores de reconhecimento padrão (PRRs).
Uma vez ativadas, as células
epiteliais secretam quimiocinas e citocinas, como CCL20, CCL27, recrutando células dendríticas
imaturas para a mucosa. O epitélio secreta também TSLP, IL-25 e IL-33, essenciais para o
recrutamento e maturação de células dendríticas e outras células da imunidade inata, como as
células NKT, natural helper, eosinófilos, mastócitos e basófilos.
Essas células são essenciais para
a resposta alérgica, pois além de expressarem moléculas MHC
classe II e moléculas coestimulatórias
secretam altas concentrações de citocinas Th2 como IL-4, IL-5 e IL-13, importantes
para o inicio e manutenção da resposta inflamatória (Figura 3)
(Holgate et al., 2010; Kim et al.,
2010).
As células apresentadoras de antígenos ativadas, especialmente as células dendríticas
fazem a interface entre a resposta imune inata e a resposta
adaptativa. Essas células capturam e
processam o alérgeno, migrando para os linfonodos drenantes e apresentando seus peptídeos, via
MHC II a linfócitos T CD4+ virgens. Juntamente com citocinas como a IL-4, possivelmente
secretadas por basófilos, mastócitos, células T CD4+ virgens se diferenciam em linfócitos Th2
secretando as citocinas Th2 IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13 e GM-CSF.
A IL-4 juntamente com IL-
13 são essenciais para a indução da mudança de classe e
secreção de IgE por plasmócitos. Essas
imunoglobulinas se ligam com alta afinidade a receptores na
superfície de basófilos ou mastócitos
e esse indivíduo estará sensibilizado (Figura 4)(Barret e Austen, 2009).
19
FIGURA 3 - A resposta imune inata na asma alérgica. O contato com o alérgeno com o epitélio pulmonar
iniciará a resposta alérgica na asma. As células epiteliais
reconhecem por receptores de reconhecimento
padrão (PRR) o alérgeno, secretando diversas citocinas e
quimiocinas, especialmente IL-25, IL-33 e TSLP,
que irão recrutar células do sistema imune inato como mastócitos, basófilos, eosinófilos, células NKT,
células natural helper, macrófagos e células dendríticas. Essas células por expressarem moléculas MHC
classe II e secretarem citocinas Th2, como IL-4, IL-5 e IL-13 são essenciais para o inicio e manutenção da
resposta Th2 decorrente da asma. Esquema modificado (Hammad
e Lambrecht, 2008).
1.2.4.2. As fases aguda e crônica
Os mastócitos e basófilos revestidos por imunoglobulinas em um segundo contato com o
alérgeno degranulam e liberam mediadores lipídicos (leucotrienos, prostaglandinas), fatores de
crescimento, quimiocinas e citocinas (IL-4, IL-13, IL-12, TNF-α, entre outros), estimulando o
influxo de células inflamatórias (Marshall, 2004). Outra célula essencial na fase aguda da doença é
o eosinófilo, um granulócito que se desenvolve na medula óssea a partir do progenitor CD34+, e
sobre estímulo das citocinas IL-3, GM-CSF e principalmente IL-5
amadurecem, saindo da medula
óssea para o sítio de inflamação. A IL-5, junto com a eotaxina e
RANTES, liberada pelas células
epiteliais pulmonares, é responsável pelo recrutamento,
proliferação, maturação e sobrevivência
dos eosinófilos. Ativadas, essas células liberam seus grânulos contendo proteínas catiônicas
básicas (PCB), peroxidase eosinofílica (PE), que levarão a lesões teciduais, e mais quimiocinas e
20
citocinas (IL-4, IL5, IL-13), estimulando o influxo leucocitário, mantendo e amplificando o ciclo
da resposta inflamatória (Rosenberg et al., 2007; Holgate e Polosa, 2008; Stone et al., 2010).
A constante exposição ao antígeno acarretará na fase crônica da doença. Os medidores
inflamatórios liberados por mastócitos e eosinófilos, e as citocinas IL-5 e IL-13 são essenciais
nessa fase, pois irão estimular a deposição de colágeno,
hiperplasia das células caliciformes,
espessamento do músculo liso e a diferenciação de fibroblastos. O
contato contínuo com o
alérgeno e o influxo leucocitário, especialmente de eosinófilos, resultará no remodelamento das
vias aéreas (Figura 4) (Holgate et al, 2010; Murdoch e Lloyd, 2010;
Sokol e Medzhitov, 2010;
Nakagome e Nagata, 2011; Deckers et al, 2013).
21
Figura 4 – Resposta Th2 na asma alérgica. A resposta inflamatória é iniciada a partir do reconhecimento
do alérgeno pelo epitélio pulmonar. Células apresentadoras de antígeno reconhecem esse antígeno, o
clivam e apresentam seus peptídeos via MHC II a células T
virgens, que se diferenciam em células Th2,
liberando citocinas como IL-4, IL-5 e IL-13. As citocinas IL-4 e IL-13
irão estimular a mudança de classe e
secreção de IgE pelas células B. Essas imunoglobulinas
específicas se ligam à receptores FcεRI na
superfície de mastócitos com alta afinidade. No segundo contato o alérgeno se liga a esses receptores,
ativando essas células, que irão degranular, liberando mediadores como histaminas, leucotrienos (LTB4),
prostaglandinas e citocinas, iniciando a resposta aguda ao
alérgeno. A citocina IL-5 liberada é essencial no
recrutamento, proliferação, maturação, ativação e sobrevivência dos eosinófilos, que ativados liberam mais
mediadores como proteínas básicas e mais citocinas. O contato contínuo com o alérgeno resultará na fase
crônica da doença, caracterizada pelo espessamento do músculo liso, ativação dos fibroblastos, depósito de
colágeno, angiogênese e aumento da produção de muco, cujas
citocinas IL-13 e IL-5 tem papel essencial.
Esquema modificado (Holgate e Polosa, 2008).
1.2.5. Tratamentos
Os tratamentos variam de paciente para paciente, e a associação de corticosteróides e
broncodilatadores ainda são os mais utilizados por possuírem ação clínica satisfatória, porém
mostram efeitos colaterais significativos e casos freqüentes de resistência. Mais recentemente,
foram desenvolvidos tratamentos baseados na modulação de
moléculas alvo da resposta alérgica,
como bloqueadores da cadeia alfa do receptor de IL-4
(Dupilumab), anti-IL-13 (Lebrikizumab) e
anticorpos anti-IgE, a exemplo do Omalizumabe, já aprovado para uso clínico. Embora esses
22
anticorpos diminuam a inflamação e melhorem a função pulmonar, tais tratamentos são
administrados juntamente com o uso dos corticosteróides. O anti-
IL-5 Mepolizumab, por levar a
redução do numero de eosinófilos, leva a diminuição da resposta inflamatória e da deposição de
matriz extracelular. De forma similar o anticorpo que bloqueia o receptor de IL-5 parece melhorar
a inflamação por meses após uma única injeção (Wenzel, 2012;
Lambrecht e Hammad, 2015).
1.2.6. Modelos animais na asma alérgica
Os modelos animais de asma têm sido muito utilizados para maior compreensão sobre os
mecanismos fisiopatológicos e para o desenvolvimento de
estratégias terapêuticas. Diversos
modelos animais já foram utilizados como ratos, cobaias,
cachorros, furões, cavalos, macacos,
ovelhas e camundongos, porém a maioria dos estudos foi feita em ratos e camundongos. Embora
camundongos não apresentem exatamente a asma como em
humanos, é possível reproduzir e
estudar diversas dessas características, como o influxo de células inflamatórias, a hiperreatividade
brônquica e o remodelamento tecidual (Halwani et al., 2010). Os principais modelos de asma são
realizados em camundongos da cepa Balb/C devido ao bom
desenvolvimento da resposta Th2. Os
protocolos mais utilizados para o desenvolvimento da resposta em camundongos são com
sensibilizações e desafios com os antígenos como o extrato do ácaro de poeira doméstica
Dermatophagoides pteronissynus (HDM) ou o antígeno derivado
da clara do ovo, ovalbumina
(OVA). No caso do modelo da OVA as sensibilizações são feitas
junto com adjuvantes como o
hidróxio de alumínio, importantes para promover o
desenvolvimento da resposta Th2 (Nials e
Uddin, 2008). O modelo de asma induzida por OVA não representa todos os tipos de asma, porém
mostra diversos aspectos inflamatórios da doença alérgica,
especialmente os altos níveis de IgE,
IL-4, IL-5 e IL-13, e hiper-reatividade brônquica, sendo um modelo importante no estudo da
fisiopatologia da doença (Kim et al., 2010).
23
2. HIPÓTESE
O uso do sangue autólogo tem efeitos terapêuticos em um modelo experimental de asma
alérgica.
3. OBJETIVOS
Objetivo Geral
Estudar os possíveis efeitos terapêuticos da hemoterapia no
modelo de asma induzida por
OVA em camundongos.
Objetivos Específicos
Analisar se o uso do sangue autólogo tem efeitos sobre os
principais parâmetros da asma
alérgica: a resposta inflamatória (recrutamento celular e secreção de citocinas Th2 como
IL-4, IL-5 e IL-13), a hiper-reatividade brônquica, hiperplasia das células de caliciformes e
secreção de muco, depósito de colágeno e os níveis de IgE
plasmáticos;
Utilizar fracionamento do sangue (plasma e hemácias) para
estabelecer a contribuição de
cada um dos seus componentes no modelo de asma alérgica.
24
4. METODOLOGIA
4.1. Desenho experimental
Foram utilizados camundongos Balb/C, fêmeas, com idades de 6-8
semanas. Em todos os
experimentos, os animais foram sensibilizados com duas injeções intraperitoneais (i.p) de OVA
Sigma (100μg/animal) em Hidróxio de Alumínio (1,6mg/animal), com intervalo de 7 dias entre a
primeira e a segunda injeção. Uma semana depois, iniciou-se uma sequencia de 6 desafios
intranasais (i.n) com OVA (10μg/animal) com intervalos de 2 a 3
dias. Este protocolo foi baseado
no estudo de Lintomen e colaboradores (2008). Após dois desafios com OVA ou salina iniciamos
uma sequência de 4 injeções intramusculares (i.m) com 10μL de sangue autólogo total ou de suas
frações ao longo de 2 semanas. No 32° dia, 24 horas após o ultimo desafio, os animais foram
anestesiados e eutanasiados para coleta de sangue, lavado
broncoalveolar (BAL), pulmões,
quadríceps e medula óssea (Figura 5).
FIGURA 5 – Desenho experimental do tratamento.
25
4.2. Retirada e Injeções intramusculares de sangue ou de suas frações
Uma vez que os animais da cepa Balb/C são isogênicos, utilizamos animais doadores do
mesmo sexo e idade para coleta de sangue para as injeções.
Foram retirados 200μL do plexo
ocular dos animais doadores com tubos capilares heparinizados (Glassyto). O sangue total retirado
foi imediatamente injetado no quadríceps dos animais, alternando entre a pata direita e esquerda
ao longo das injeções para evitar maiores lesões teciduais. Após a injeção de 10 μL sangue total o
sobressalente foi centrifugado por 7 minutos a 10000 rpm para separação das frações. Após a
centrifugação, 10μL de plasma ou hemácias foram aplicados nos quadríceps dos animais. Pouca
heparina foi utilizada e as injeções foram feitas rapidamente para evitar coagulação. As
quantidades de sangue ou de suas frações utilizadas foram
padronizadas baseadas no tratamento
realizado em humanos, além de considerar a quantidade média de sangue corporal.
4.3. Animais e grupos
Os animais foram mantidos no biotério do Laboratório de
Inflamação e Imunidade, em
ambiente com temperatura e ciclo claro-escuro controlados, e acesso irrestrito a água e ração. Nos
primeiros experimentos para a análise dos efeitos da hemoterapia, todos os animais foram
sensibilizados com injeções intraperitoneais de OVA e divididos em 4 grupos:
O primeiro grupo foi dos animais usados como controle negativo, desafiados com
salina estéril intranasal e com injeções intramusculares de salina estéril;
O segundo grupo foi formado com animais desafiados com salina estéril intranasal
e injetados com sangue próprio;
O terceiro grupo é o controle positivo, com animais desafiados com OVA
intranasal e injetados com salina estéril;
Os animais do quarto e último grupo foram desafiados com OVA
intranasal e
tratados com injeções intramuscultares de sangue próprio.
Em experimentos posteriores para estudar os efeitos de cada
fração do sangue, todos os
animais também foram sensibilizados com injeções de OVA i.p
sendo formados então os
seguintes grupos:
Controle negativo, com animais desafiados com salina estéril intranasal e injetados
com salina estéril intramuscular;
26
Controle positivo, com animais desafiados com OVA intranasal e injetados com
salina estéril intramuscular;
O grupo com animais desafiados com OVA intranasal e tratados com injeções de
sangue total;
O grupo de animais desafiados com OVA intranasal e com injeções com plasma
intramusculares;
Ultimo grupo desafiado com OVA intranasal e com injeções
intramusculares de
hemácias.
4.4. Coleta das amostras
Antes do sacrifício dos animais, retiramos uma gota de sangue da cauda para montagem
das lâminas de esfregaço e mais 5μL para contagem total de células na câmara de Neubauer. Os
animais foram anestesiados e sacrificados com isofluorano inalado para coleta de sangue e
canulação para a lavagem broncoalveolar com 1,2 mL de salina estéril. Retiramos os pulmões,
separamos o lobo esquerdo para ELISA, e o lobo direito foi
colocado em 5mL de 10%
Formol/PBS para histologia. As colorações de hematoxilina-eosina (HE), Picrosirius e PAS foram
realizadas para analisar o infiltrado celular, deposição de colágeno e a produção de muco nos
pulmões, respectivamente.
A medula óssea do fêmur da pata injetada por ultimo com salina, sangue ou suas frações
foi retirada e lavada com 2 mL de salina estéril para retirada de células. Após montagem da
câmara de Neubauer para contagem total, as amostras foram
centrifugadas por 10mins a
14000rpm e o sobrenadante foi coletado e estocado a -20oC para posterior dosagem de citocinas
por ELISA. O sangue coletado foi centrifugado por 7 minutos a 10000rpm e o BAL por 10
minutos a 500G. Em seguida, o plasma e o sobrenadante do BAL
foram aliquotados e estocados a
-20oC para posterior dosagem de IgE e de citocinas por ELISA.
Paralelamente, o sedimento do
BAL foi ressuspendido em 200 μL de salina para contagem total e diferencial das células.
4.5. Contagem celular total e diferencial
A contagem do número de células total do BAL, sangue e medula óssea foi realizada na
câmara de Neubauer, com a diluição de 1:20 em solução de
corante líquido de Turk (solução de
violeta gensiana e ácido acético 2%). Para a contagem diferencial, o sedmento do BAL
27
ressuspendido em salina e as células lavadas da medula óssea foram centrifugadas por 5 minutos
(CITOCENTRÍFUGA DAMON/IEC Division) e coradas com panótico
rápido (Laborclin® ref.
620529). Utilizando o microscópio óptico OLYMPUS BX40 acoplado a um monitor, as células
foram identificadas com base nas suas características
morfológicas, sendo classificadas em
mononucleares, eosinófilos e neutrófilos. Foi utilizada a lente objetiva no aumento de 100X com
óleo de imersão para microscópio (Merck®, lote HX118077), e as
lâminas foram contadas por três
vezes, utilizando a média aproximada como resultado.
4.6. Quantificação de citocinas
As concentrações de IgE e de citocinas foram determinadas pelos testes de ELISA
(Peprotech®), a partir de amostras BAL e extrato pulmonar. As
placas foram cobertas com 100μL
por poço com os anticorpos de captura. Posteriormente foram
lavadas com PBS/Tween 0,05% por
3 vezes e bloqueadas com 300μL por poço de PBS/BSA 1% por 1
hora, também a temperatura
ambiente. Lavamos por 3 vezes com PBS/Tween 0,05%, aplicando 100μL dos padrões com
diluições seriadas (1:2), além das amostras. As placas foram incubadas na geladeira por 24 horas.
Lavamos 3 vezes com PBS/Tween 0,05%, incubando as placas por 2 horas com 100μL por poço
do anticorpo de detecção a temperatura ambiente. Lavamos 4
vezes com PBS/Tween 0,05%,
incubando as placas com 100μL de estreptoavidina (1:4000) por 30
minutos a temperatura
ambiente, no escuro, lavando mais 4 vezes com PBS/Tween
0,05%. Adicionamos para revelação
100μL de uma solução de TMB 1% (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina)
em DMSO (Dimetil sufóxido),
peróxido de hidrogênio (H2O2) e tampão citrato fosfato, incubando as placas no escuro por até 15
minutos, dependendo da intensidade da cor. A leitura foi realizada no espectofotômetro a um
comprimento de onda de 450nm. As concentrações dos anticorpos de captura e detecção e dos
pontos das curvas padrões variaram de acordo com as citocinas (Tabela 1).
Citocinas Curva Padrão Anticorpo de
captura
Anticorpo de
detecção
IL-4 (kit n°900-K49,
lote #0708049)
2000 a 16pg/ml 1μg/ml 1μg/ml
IL-5 (kit n°900-K406,
lote #1111406)
2000 a 32pg/ml 1μg/ml 0,5μg/ml
IL-13 (kit n°900-
K207, lote #1009207)
1000 a 16pg/ml 0,5μg/ml 0,5μg/ml
Tabela 1 – Concentrações respectivas ao kits Peprotech® das citocinas IL-4, IL-5 e IL-13.
28
4.7. Histologia
Os tecidos foram retirados dos animais e colocados em seguida em 10% Formol/PBS.
Após 48 horas foram transferidos para álcool 70%.
4.7.1. Processamento
Os pulmões e músculos foram cortados de forma longitudinal e colocados em cassetes.
Imediatamente foi feita a desidratação em banhos com uma bateria crescente de álcool: 80%;
95%; 100%; 100%. Posteriormente os tecidos foram clarificados com 2 banhos de xilol. Cada
banho com duração de 30 minutos.
4.7.2. Inclusão em Parafina e microtomia
Após a clarificação os tecidos passaram por 2 banhos de parafina a 50°C, de 1 hora cada,
sendo incluídos então em blocos de parafina. Após inclusão os blocos foram cortados no
micrótomo com cortes de 5mm de espessura e colocados em
lâminas.
4.7.3. Desparafinização e Reidratação
Antes das colorações os cortes foram desparafinizados em 2
banhos de xilol, de 1 minuto
cada. Imediatamente foram então reidratados com 2 banhos de
álcool 100% e 1 banho de álcool
70%, 5 minutos cada. Após o ultimo banho de álcool os cortes passaram por um banho de água
mili-Q de 15 a 20 minutos.
4.8. Colorações
4.8.1. Hematoxilina-eosina (HE)
Para análise do infiltrado inflamatório nos pulmões fizemos a coloração de HE. As lâminas
foram coradas com Eosina e Hematoxilina de Harris (Sigma), de acordo com o protocolo do
Laboratório Multidisciplinar do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho - UFRJ.
4.8.2. Picrosirius
Para analisar a deposição de colágeno ao redor de brônquios e vasos coramos as lâminas
com picrosirius. As lâminas foram coradas com ácido pícrico (2,4,6-
trinitrofenol), de acordo com
o protocolo do Laboratório Multidisciplinar do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho -
UFRJ.
29
4.8.3. Periodic acid-Schiff (PAS)
Para marcar as células caliciformes e muco, as lâminas foram coradas com reagente de
Schifft previamente preparado, de acordo com o protocolo do
Laboratório Multidisciplinar do
Hospital Universitário Clementino Fraga Filho - UFRJ.
4.8.4. Desidratação e montagem de lâminas
Após as colorações as lâminas foram desidratadas e clarificadas com banhos em uma
bateria de álcool 70%, 100%, 100%, 100%, e com 3 banhos de
xilol, todos de aproximadamente 1
minuto. Por fim as lâminas foram montadas com Entellan (Sigma).
4.9. Quantificação de colágeno
Após a coloração com Picrosirius as fibras colágenas foram
quantificadas pelo programa
Image-Pro Plus Demo. O programa compara foto a foto padrões de pixels previamente fixados,
tanto para área total das fotos, quanto para área de fibras
colágenas coradas em vermelho, gerando
valores numéricos para cada foto.
4.10. Quantificação de muco
Para quantificação do muco, observamos no microscópio óptico células coradas com PAS.
A partir das células PAS+ fizemos um score semi-quantitativo, duplo-cego para cada animal.
Usamos um score com cinco pontuações diferentes, de acordo
com o número de células coradas
por brônquio. Score semi-quantitativo: 0 – 0%; 1 – 0 a 25%; 2 –
25% a 50%; 3 – 50% a 75%; 4 –
75% a 100 (Trifilieff et al, 2000). As pontuações foram dadas para cada brônquio, sendo somadas
e divididas pelo número de brônquios analisados (10-20 brônquios por animal).
4.11. Análise estatística
Os gráficos das contagens total e diferencial e dos testes de ELISA
foram criados com o
uso do programa Graph Prim 5.0, assim como as análises
estatísticas. O teste estatístico utilizado
foi teste t (e não paramétrico), comparando os grupos 2 a 2, considerando resultados com p<0,05
significativos estatisticamente.
30
5. RESULTADOS
5.1. O uso do sangue autólogo influencia o recrutamento celular para os pulmões.
Para estudar os efeitos do uso do sangue autólogo na resposta inflamatória decorrente da
asma, analisamos inicialmente o número de leucócitos no BAL e no sangue dos animais. No BAL,
observamos que os animais alérgicos mostraram um número maior de leucócitos recrutados para
os pulmões do que os animais não desafiados. O maior influxo de leucócitos para os pulmões dos
animais desafiados com OVA mostra a existência de uma resposta inflamatória decorrente dos
desafios com o alérgeno (Figura 7A). O número de células
mononucleares nos animais alérgicos e
tratados com sangue foi maior que no grupo de animais desafiados com salina (Figura 7B). Já o
número de neutrófilos é maior nos dois grupos de animais
desafiados com OVA quando
comparados aos animais não desafiados (Figura 7C). Quando
observamos o recrutamento dos
eosinófilos, animais desafiados com OVA apresentaram números significativamente maiores que
os animais desafiados com salina, como o esperado.
Interessantemente, os animais desafiados com
OVA e tratados com injeções de sangue, apresentaram número de eosinófilos no BAL
significativamente diminuído (Figura 7 D). O tratamento com
sangue, embora tenha diminuído o
recrutamento de eosinófilos não diminuiu o influxo de leucócitos para os pulmões, mostrando a
existência de um processo inflamatório decorrente dos 6 desafios com OVA. As médias
estatísticas geradas estão discriminadas na tabela 2.
Grupos x Grupos SEM (Células x 106/BAL) N
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Salina
i.m
Cél. Total: 0,5740±0,07254 e 2,964±0,2144
Céls. Mono.: 0,5450±0,06921 e 1,031±0,1001
Neutrófilos: 0,0170±0,003350 e 0,0925±0,01740
Eosinófilos: 0,0050±0,002236 e 1,053±0,1749
N=10
N=8
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Sangue
Total i.m
Cél. Total: 0,5740±0,07254 e 2,438±0,3511
Céls. Mono.: 0,5450±0,06921 e 1,123±0,1676
Neutrófilos: 0,0170±0,003350 e 0,1163±0,02815
Eosinófilos: 0,0050±0,002236 e 0,6013±0,05848
N=10
N=8
OVA i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Sangue
Total i.m
Cél. Total: 2,964±0,2144 e 2,438±0,3511
Céls. Mono.: 2,964±0,2144 e 1,123±0,1676
Neutrófilos: 2,964±0,2144 e 1163±0,02815
Eosinófilos: 2,964±0,2144 e 0,6013±0,05848
N=8
N=8
Tabela 2 – Dados da Figura 7, representados em Média±Erro padrão da média (SEM).
31
A) B)
C) D)
FIGURA 7 – Os efeitos da hemoterapia no influxo de células inflamatórias para os pulmões.
Contagem do número de células totais (A), mononucleares (B), neutrófilos (C) e eosinófilos (D) no BAL.
Dados representados como Média±Erro padrão da média (SEM)
de 2 experimentos independentes, com n=
8-10. * representa diferença significativa (P< 0,05) entre dois grupos comparados par a par por teste t.
Salina
Sangue
Salina
Sangue
0
1
2
3
4
Salina OVA
*
*
Nº células x 10 6 / BAL
Salina
Sangue
Salina
Sangue
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Salina OVA
*
N° mononucleares x 10 6 / BAL
Salina
Sangue
Salina
Sangue
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
Salina OVA
*
*
N° neutrófilos x 10 6 / BAL
Salina
Sangue
Salina
Sangue
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Salina OVA
*
* *
N° eosinófilos x 10 6 / BAL
32
5.2. As injeções de sangue influenciaram o número neutrófilos no sangue periférico dos
animais alérgicos tratados com sangue.
A fim de observar se o uso do sangue tem efeito também no
número de leucócitos
circulantes, fizemos esfregaços sanguíneos para contagem
diferencial 24 horas após o ultimo
desafio com OVA. Observamos que a quantidade de leucócitos não foi diferente entre os animais
alérgicos e não alérgicos, assim como o número de células
mononucleares e eosinófilos (Figuras
8A, 8B e 8D). Porém, o número de neutrófilos nos animais
alérgicos tratados com sangue foi
maior que nos animais não desafiados com OVA (Figura 8C).
Esses resultados mostram que o
tratamento com sangue aumenta o recrutamento de neutrófilos
para o BAL e o número de
neutrófilos no sangue, sugerindo que o tratamento influencia no trânsito de neutrófilos, células
com papel ainda pouco claro na asma alérgica. As médias
estatísticas geradas estão discriminadas
na tabela 3.
Grupos x Grupos SEM (Células x 106/mL) N
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Salina
i.m
Cél. Total: 16,86±1,467 e 2,964±0,2144
Céls. Mono.: 11,83±0,9925 e 13,02±1,391
Neutrófilos: 3,848±0,9175 e 2,301±0,5301
Eosinófilos: 1,503±0,3661 e 2,036±0,4915
N=10
N=9
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Sangue
Total i.m
Cél. Total: 16,86±1,467 e 14,76±2,457
Céls. Mono.: 11,83±0,9925 e 9,170±1,477
Neutrófilos: 3,848±0,9175 e 3,879±1,273
Eosinófilos: 1,503±0,3661 e 2,126±0,6510
N=10
N=9
OVA i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Sangue
Total i.m
Cél. Total: 17,21±1,586 e 14,76±2,457
Céls. Mono.: 13,02±1,391 e 9,170±1,477
Neutrófilos: 3,879±1,273 e 3,879±1,273
Eosinófilos: 2,036±0,4915 e 2,126±0,6510
N=9
N=9
Tabela 3 – Dados da Figura 8 representados como Média±Erro padrão da média (SEM).
33
A) B)
C) D)
FIGURA 8 – Os efeitos da hemoterapia no número de leucócitos no sangue. Contagem do número de
células total (A), mononucleares (B), neutrófilos (C) e eosinófilos (D) no sangue periférico 24 horas após o
último desafio com OVA. Dados representados como Média±Erro
padrão da média (SEM) de 2
experimentos independentes, com n= 9-10. * representa diferença significativa (P< 0,05) entre dois grupos
comparados par a par por teste t.
Salina
Sangue
Salina
Sangue
0
10
20
30
Salina OVA
Nº células x 10 6 / mL
Salina
Sangue
Salina
Sangue
0
5
10
15
20
25
Salina OVA
N° mononucleares x 10 6 / mL
Salina
Sangue
Salina
Sangue
0
5
10
15
Salina OVA
*
N° neutrófilos x 10 6 / mL
Salina
Sangue
Salina
Sangue
0
2
4
6
8
Salina OVA
N° eosinófilos x 10 6 / mL
34
5.3. O tratamento com sangue total e com hemácias diminuiu o influxo de células
inflamatórias para os pulmões dos animais desafiados com OVA
Os resultados anteriores mostraram a influência do uso do sangue sobre alguns parâmetros
inflamatórios no modelo de asma experimental. Com isso,
decidimos estudar qual a fração do
sangue estaria desempenhando esse papel. Assim como nos
primeiros experimentos, todos os
animais foram sensibilizados com OVA e passaram por 6 desafios com OVA e 4 injeções
intramusculares de salina, sangue total, plasma ou hemácias. No BAL, todos os animais
desafiados com OVA mostraram maior influxo leucocitário para os pulmões quando comparados
ao grupo salina, mostrando a existência de um processo
inflamatório local resultante dos desafios
com OVA (Figura 9A). Ao realizarmos as contagens diferenciais no BAL para identificar os tipos
celulares recrutados, vimos que o número de células
mononucleares não foi alterado entre os
grupos e, diferente dos experimentos anteriores, o número de neutrófilos foi maior em todos os
grupos de animais asmáticos tratados ou não (Figuras 9 B e 9C).
Analisando o recrutamento de
eosinófilos para os pulmões, vimos que este influxo foi maior nos animais desafiados com OVA
do que nos animais controle desafiados com salina. No entanto, os animais desafiados com OVA e
tratados com sangue total ou hemácias apresentaram um menor
número de eosinófilos em relação
aos animais alérgicos sem tratamento. Por outro lado, o tratamento dos animais com a fração de
plasma livre de células não foi eficaz em reduzir esse recrutamento (Figura 9D).
Baseados nesses resultados, concluímos que apenas o uso do
sangue total e das hemácias
tem um efeito de inibir o influxo das células inflamatórias para os pulmões, uma característica
importante para o inicio e manutenção da resposta Th2
característica da asma.
35
Grupos x Grupos SEM (Células x 106/BAL) N
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Salina
i.m
Cél. Total: 0,700±0,08169 e 2,658±0,3504
Céls. Mono.: 1,500±0,215 e 1,190±0,806
Neutrófilos: 0,3385±0,01238 e
0,1085±0,01395
Eosinófilos: 0,01308±0,006444 e
1,414±0,2299
N=13
N=13
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Sangue
Total i.m
Cél. Total: 0,700±0,08169 e 2,093±0,2672
Céls. Mono.: 1,500±0,215 e 1,218±0,1490
Neutrófilos: 0,3385±0,01238 e
0,1450±0,0186
Eosinófilos: 0,01308±0,006444 e
0,7408±0,1417
N=13
N=12
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Plasma
i.m
Cél. Total: 0,700±0,08169 e 2,040±0,1940
Céls. Mono.: 1,500±0,215 e 1,622±0,1072
Neutrófilos: 0,3385±0,01238 e
0,1789±0,03615
Eosinófilos: 0,01308±0,006444 e
0,9975±0,1662
N=13
N=9
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n +
Hemácias i.m
Cél. Total: 0,700±0,08169 e 2,099±0,3377
Céls. Mono.: 1,500±0,215 e 1,084±0,1727
Neutrófilos: 0,3385±0,01238 e
0,2178±0,05823
Eosinófilos: 0,01308±0,006444 e
0,5550±0,06604
N=13
N=9
OVA i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Sangue
Total i.m
Cél. Total: 2,658±0,3504 e 2,093±0,2672
Céls. Mono.: 1,190±0,1806 e 1,218±0,1490
Neutrófilos: 0,1085±0,01395 e 0,1450±0,0186
Eosinófilos: 1,414±0,2299 e 0,7408±0,1417
N=13
N=12
OVA i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Plasma
i.m
Cél. Total: 2,658±0,3504 e 2,740±0,2029
Céls. Mono.: 2,658±0,3504 e ± 1,622±0,1072
Neutrófilos: 0,1085±0,01395 e 0,1789±0,03615
Eosinófilos: 1,414±0,2299 e 0,9975±0,1662
N=13
N=9
OVA i.n + Salina i.m
versus OVA i.n +
Hemácias i.m
Cél. Total: 2,658±0,3504 e 2,099±0,3377
Céls. Mono.: 2,658±0,3504 e 1,084±0,1727
Neutrófilos: 0,1085±0,01395 e 0,2178±0,05823
Eosinófilos: 1,414±0,2299 e 0,5550±0,06604
N=13
N=9
Tabela 4 – Dados da figura 9 representados como Média±Erro padrão da média (SEM).
36
A) B)
C) D)
FIGURA 9 - Os efeitos da hemoterapia e suas frações no influxo de células inflamatórias para os
pulmões. Contagem do número de células total (A), mononucleares (B), neutrófilos (C) e eosinófilos (D)
no BAL de animais desafiados com OVA ou salina e tratados com sangue intramuscular ou suas fraçoes.
Dados representados como Média±Erro padrão da média (SEM)
de 2 experimentos independentes, com n=
9-13. * representa diferença significativa (P< 0,05) entre dois grupos comparados par a par por teste t.
***Grupo diferente de todos os outros.
Salina
Salina
Sangue Total
Plasma
Hemácias
0
2
4
6
Salina OVA
***
Nº células x 10 6 / BAL
Salina
Salina
Sangue Total
Plasma
Hemácias
0
1
2
3
4
Salina OVA
N° mononucleares x 10 6 / BAL
Salina
Salina
Sangue Total
Plasma
Hemácias
0.0
0.2
0.4
0.6
Salina OVA
***
N° neutrófilos x 10 6 / BAL
*
Salina
Salina
Sangue Total
Plasma
Hemácias
0
1
2
3
4
Salina OVA
*
*
***
N° eosinófilos x 10 6 / BAL
37
5.4. O tratamento com hemácias diminui o número de neutrófilos no sangue dos animais
desafiados com OVA.
A fim de observar se o uso do sangue e suas frações tem efeito também no número de
células inflamatórias no sangue, 24 horas após o ultimo desafio fizemos esfregaços sanguíneos
para contagem diferencial. Vimos que a quantidade total de
leucócitos, de células mononucleares,
e eosinófilos não foram diferentes entre os animais desafiados ou não, porém o número de
neutrófilos estava diminuído no sangue dos animais alérgicos e tratados com hemácias (Figuras
10A - D). Analisando esse parâmetro, apenas o tratamento com hemácias mostrou influência sobre
o número de células no sangue, diferente do tratamento com
sangue total ou plasma.
38
Grupos x Grupos SEM (Células x 106/mL) N
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Salina
i.m
Cél. Total: 18,54±1,368 e 18,36±1,597
Céls. Mono.: 12,51±1,034 e 13,01±1,556
Neutrófilos: 5,282±0,7762 e 4,528±0,6507
Eosinófilos: 0,7638±0,09900 e 0,7585±0,1450
N=13
N=13
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Sangue
Total i.m
Cél. Total: 18,54±1,368 e 19,62±1,715
Céls. Mono.: 12,51±1,034 e 12,13±1,579
Neutrófilos: 5,282±0,7762 e 6,251±0,7904
Eosinófilos: 0,7638±0,09900 e 0,7958±0,1312
N=13
N=12
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Plasma
i.m
Cél. Total: 18,54±1,368 e 18,44±1,841
Céls. Mono.: 12,51±1,034 e 14,66±1,623
Neutrófilos: 5,282±0,7762 e 3,421±0,3361
Eosinófilos: 0,7638±0,09900 e 0,6322±0,1118
N=13
N=9
Salina i.n + Salina i.m
versus OVA i.n +
Hemácias i.m
Cél. Total: 18,54±1,368 e 20,28±2,168
Céls. Mono.: 12,51±1,034 e 16,70±2,012
Neutrófilos: 5,282±0,7762 e 2,731±0,1410
Eosinófilos: 0,7638±0,09900 e 0,5667±0,1273
N=13
N=9
OVA i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Sangue
Total i.m
Cél. Total: 18,36±1,507 e 19,62±1,715
Céls. Mono.: 13,01±1,556 e 12,13±1,579
Neutrófilos: 4,528±0,6507 e 6,251±0,7904
Eosinófilos: 0,7585±0,1450 e 0,7958±0,1312
N=13
N=12
OVA i.n + Salina i.m
versus OVA i.n + Plasma
i.m
Cél. Total: 18,36±1,507 e 18,44±1,841
Céls. Mono.: 13,01±1,556 e 14,66±1,623
Neutrófilos: 4,528±0,6507 e 3,421±0,3361
Eosinófilos: 0,7585±0,1450 e 0,6322±0,1118
N=13
N=9
OVA i.n + Salina i.m
versus OVA i.n +
Hemácias i.m
Cél. Total: 18,36±1,507 e 20,28±2,168
Céls. Mono.: 13,01±1,556 e 16,70±2,012
Neutrófilos: 4,528±0,6507 e 2,731±0,1410
Eosinófilos: 0,7585±0,1450 e 0,5667±0,1273
N=13
N=9
Tabela 5 – Dados da figura 10 representados como Média±Erro padrão da média (SEM).
39
A) B)
C) D)
FIGURA 10 - Os efeitos da hemoterapia e suas frações no número de células inflamatórias no
sangue. Contagem do número total de células (A), mononucleares (B), neutrófilos (C) e eosinófilos (D) no
sangue de animais desafiados com OVA e tratados com sangue
intramuscular ou suas frações. Dados
representados como Média±Erro padrão da média (SEM) de 2
experimentos independentes, com n= 9-13. *
representa diferença significativa (P< 0,05) entre dois grupos comparados par a par por teste t.
Salina
Salina
Sangue Total
Plasma
Hemácias
0
10
20
30
40
OVA
Salina
Nº células x 10 6 / mL
Salina
Salina
Sangue Total
Plasma
Hemácias
0
10
20
30
OVA
Salina
N° mononucleares x 10 6 / mL
Salina
Salina
Sangue Total
Plasma
Hemácias
0
5
10
15
Salina OVA
*
*
N° neutrófilos x 10 6 / mL
Salina
Salina
Sangue Total
Plasma
Hemácias
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Salina OVA
N° eosinófilos x 10 6 / mL
40
5.5. O tratamento com sangue total e com hemácias tem influência sobre o número total de
leucócitos e de eosinófilos na medula óssea dos animais
asmáticos.
Para avaliar melhor o recrutamento celular e a influência da hemoterapia no neste modelo,
analisamos o número e tipos celulares presentes na medula óssea.
Após 24 horas do ultimo
desafio, coletamos as células de medula do fêmur da ultima injeção para as contagens de células
totais e diferenciais. A fim de analisar se o uso do sangue e suas frações influenciam o número de
leucócitos na medula óssea, contabilizamos o número total de células e observamos que o grupo
de animais asmáticos tratados com hemácias apresentaram uma
quantidade de células na medula
diminuída em relação aos animais não alérgicos e aos animais alérgicos não tratados (Figura 11A).
Realizamos então as contagens diferenciais das lâminas d
10/11/2015 13:59
De: Evaristo da Veiga
IP: 187.61.223.11

Ferida

Remédio não deu jeito; auto-hemoterapia resolveu
Uma prova forte da eficácia da auto-hemoterapia foi mostrada hoje. Após passar por vários médicos, com suspeita de Câncer e sem resultado nos tratamentos indicados, o cidadão Juvino dos Anjos Filho, 74 anos estava aflito, com uma ferida de nove
centímetros na perna. Em 29 de agosto de 2015 resolveu passar a fazer auto-hemoterapia em sua residência,na zona sul de Natal -
RN, com aplicações semanais e curativos banhados com cloreto de magnésio dissolvido em água.
Dois meses depois da primeira aplicação, a ferida está
praticamente cicatrizada, sem que ele tenha usado nenhuma
medicação; somente com as aplicações da auto-hemoterapia e
cloreto de magnésio. Os familiares de seu Juvino afirmam que “Isso é uma prova de que o sangue cura a própria pessoa”. As
receitas médicas que indicaram a medicação usada anteriormente e que não deram resultado estão guardadas. Nesta terça-feira, 10.11.2015, seu Juvino recebeu mais uma aplicação de auto-
hemoterapia e pediu que fosse feita uma foto do local.
Seu IP: 54.90.148.124 (os IP's são armazenados por questões de segurança)
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